病毒的分类及微生物检验

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,病毒的分类,一、,分类原则,核酸的性质与结构,病毒大小与形态,衣壳对称性和壳粒数目,有无包膜,对理化因素的敏感性,抗原性,生物学特性（繁殖方式、宿主范围、传播途径和致病性）,二、病毒分类系统和命名,（一）病毒分类一般系统,病毒分类系统将病毒分类为 科,(families),、,属,(genera),、种,(species),等三级，或科、亚科、,属、种等四级。,根据病毒体的形态、基因结构和复制模式,等特征将病毒分为科和亚科；,在科或亚科中又根据理化特性和血清学特,性等分病毒属，属名后缀为,virus,，属下分为,不同的病毒种。,分类,可将病毒分为科、亚科和属,常用核酸类型分类,1,DNA virus (DNA,病毒中有9科),2 RNA virus (,ssRNA,7,科.,ssRNA,7,科.,dsRNA,2,科),3,反转录病毒 (,DNA,和,RNA,反转录病毒中有2科),依传播方式和感染部位分类,1 虫媒病毒,2 肠道病毒,3 呼吸道病毒,4 肝炎病毒,5 性传播病毒,（二）非寻常病毒的分类,1 卫星病毒（,satellites）,2,类病毒（,viroids,）,3,朊粒（,prion,）,第三节,病毒学诊断,自身免疫病和肿瘤密切相关。病毒性疾病在人类疾病中占有十分重要的地位。由于病毒感染的防治原则不同于细菌等其他微生物，尽早判定病人感染或某传染病的流行是由病毒所致，是医生和微生物学实验室的责任和任务。病毒的分离与鉴定当然是病毒病原学诊断的金标准，但因病毒是严格细胞内寄生，病毒分离必须,有活的细胞支持，故病毒的分离鉴定较困难。,一、标本的采集、运送和处理,1.,应在感染早期（发病,1,2,天内）采集。,2.,必须无菌操作，对用于病毒分离培养的污染标本用,高浓度抗生素处理过夜，必要时需加抗真菌药物等,3.,及时送检，送检的组织等可放入含有抗生素的,50%,甘油缓冲盐水或二甲基亚砜中低温冷藏。,4.,血清学检查的标本，尤其检测抗病原体的,IgG,型抗,体，应分别在发病初期和恢复期采集双份血清，只,有当恢复期血清抗体效价比初期升高,4,倍或以上，,才具有确诊意义。,分离培养鉴定,(污染标本用抗生素处理过夜,),快速诊断,鸡胚,红细胞凝集试验,红细胞凝集抑制试验,细胞培养,CPE,电镜检测,中和试验,TCID50,pfu,测定,MOI,测定,动物接种,观察发病情况,中和试验,免疫学检测,ID50,测定,LD50,测定,形态学,电镜观察,病毒颗粒,（大小、,形态）,光学显微镜观察,包涵体,抗原,检测,ELISA,IF,RIA,WB,核酸检测,核酸电泳,核酸杂交,PCR,基因芯片,基因测序,抗体,检测,ELISA,RIA,IF,WB,病毒成分检测,标本采集,二、病毒的分离与鉴定,以下情况需考虑进行病毒分离与鉴定：,1.,病程长且诊断困难的病人。,2.,怀疑为新现病毒（,emergent virus,）,感染或已被消灭 的病毒性疾病怀疑“死灰复燃”。,3.,为鉴别临床上具有相同症状的疾病。,4.,监测所用减毒活疫苗。,5.,用于病毒生物学性状的研究或流行病学调查等。,（一）病毒的分离培养,1细胞培养：,原代培养细胞、二倍体细胞株、传代细胞 系或株 标本接种后溶细胞型感染病毒可致细胞出现细胞病毒效应（,CPE），,稳定感染病毒细胞并不出现明显病变，但被感染的细胞膜表面会表达病毒蛋白等标志物，如血凝素、神经氨酸酶、病毒特异性抗原等。,2鸡胚培养和动物接种,：流感病毒的分离培养虽可用犬肾传代细胞（,MDCK）,但鸡胚接种仍是最常用的敏感而特异的方法。动物接种是最原始的分离病毒的方法，但目前少用。,（二）病毒的鉴定,1病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标（1）细胞病变（,cytopathic,effect,CPE,）,大多数病毒属溶细胞型感染，在敏感细胞内增殖会出现,CPE,。,CPE,表现为细胞内颗粒增多、圆缩、聚集、融合，有的可形成包涵体，出现细胞溶解、脱落、死亡等。,不同病毒的,CPE,特征不同。因此，观察病毒所致,CPE,的特点，根据细胞类型，细胞病变种类可对标本中感染的病毒进行判定。,脊髓灰质炎病毒感染所致,CPE,a.,未感染的,vero,细胞（一种非洲绿猴肾细胞系）,b.,脊髓灰质炎病毒感染的,vero,细胞（显示细胞圆缩、分散、,坏死、脱落）。,（2）红细胞吸附（,hemadsorption,）,包膜上带有血凝素的病毒感染敏感细胞后，血凝素会出现于细胞膜表面，使感染细胞能与加入的红细胞结合出现红细胞吸附现象，这是检测正粘病毒和副粘病毒的间接指标,。,（3）中和试验（,neutralization test,NT）,用抗某病毒血清先与待测病毒悬液混合，经作用一定时间后接种敏感细胞，培养后观察,CPE,或 红细胞吸附现是否消失，即特异性抗体是否能 中和相应病毒的感染。如用不同浓度的抗血清 进行中和试验，还可根据抗体的效价对待测病毒 液进行半定量检测。,（1）空斑形成试验（,plaque formation）,（2）50%组织细胞感染量,（3）感染复数,（,Multiplicity of infection,MOI）,2病毒感染性测定及病毒数量测定,三、病毒感染的快速诊断,病毒的分离与鉴定是病毒诊断的金标准，但临床实验室应用困难，而且费时，对临床病毒感染症的诊治帮助不大。快速诊断主要指临床标本绕过分离培养复杂而较长的过程，直接在电镜下观察病毒颗粒，或直接检测标本中的病毒成分和,IgM,抗体等，以作出快速和早期诊断。,（一）形态学检查,1电镜和免疫电镜检查,含有高浓度病毒颗粒（10,7,颗粒/,ml）,的样品，可直接应用电镜技术观察。对含低浓度病毒的样本可用免疫电镜技术，或用超速离心机将标本离心进行电镜观察，以提高检出率和特异性。电镜下不仅能观察病毒的形态学特征，还可测量病毒的大小。,2光学显微镜检查,病理标本或含有脱落细胞及针吸细胞的标本检测病毒包涵体。包涵体对病毒的诊断有一定价值。观察病毒,CPE,。病理标本根据病理特征，再配合组化染色技术进行诊断。,（二）病毒蛋白抗原检测,1.,酶联免疫技术,（,ELISA）2.,免疫荧光标记技术,（,IF）3.,放射免疫标记,（,SPRIA）,这些技术操作简便、特异性强、敏感性高。尤其使用单克隆抗体标记技术可测到,ng（10,-9,g）,至,pg（10,-12,g）,水平的抗原或半抗原。其中由于放射性核酸可引起放射性污染，已逐渐被非放射性标记物（如地高辛等）所代替。,（三）早期抗体检测,1,IgM,型特异抗体检测,检测病毒感染机体产生的特异性,IgM,，如孕妇羊水中查到,IgM,型特异抗体可早期诊断某些病毒引起的胎儿先天性感染；,IgM,抗体测定有助于早期诊断，但感染机体产生,IgM,抗体有明显个体差异。,2,免疫印迹试验（,Western blot,WB,）,某些病毒感染的诊断需持慎重认真的作法。如,AIDS,和成人白血病等，在初筛试验阳性后，尚需用,WB,法进行确认试验。,（四）检测病毒核酸,1核酸电泳：正粘病毒属和呼肠病毒属的核酸是分节段 的，甲型流感病毒8个节段，轮状病毒11个节段。从 标本中直接提取轮状病毒的核酸，经聚丙烯酰胺凝胶 电泳（,PAGE）,和银染色后在凝胶板上清楚核酸条 带，结合临床情况可进行诊断。2核酸杂交：其原理是应用已知序列的核酸单链作为探 针（,probe），,探针预先用放射性核素（,32,P,或,131,I）,或 生物素、地高辛苷原、辣根过氧化物酶等标记，在一 定条件下按碱基互补规律与标本,（,1,）斑点杂交（,dot blot hybridization,）：,（,2,）原位杂交（,in site hybridization,）：,（,3,）,DNA,印迹（,southern blot,）和,RNA,印迹,（,northern blot,）杂交技术,3,聚合酶链反应（,PCR,）,4,基因芯片技术（,gene chip,）,5,基因测序 包括病毒全基因测序和特征性基因,片段的测序。,