蛋白质及氨基酸的测定

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第九章 蛋白质及氨基酸的测定,9.1,概述,蛋白质是一类存在于所有细胞中含量丰富的成分，除了储备蛋白质外，几乎所有的蛋白质对生物功能和细胞结构都非常重要。,食品中的蛋白质种类非常复杂，其中很多已经被纯化和定性。蛋白质分子质量的变化范围通常为50001000000,u，,它们包括氢、碳、氮、氧和硫等元素，20种常见,-,氨基酸是蛋白质的主要构成。,蛋白质可以按照它的成分、结构、生物功能或者溶解特性来分类。如水解简单蛋白质只得到氨基酸，但结合类蛋白质还含有非氨基酸成分。,蛋白质有非常独特的构型，它可被各种变性因素，如热、酸、碱、8,molL,尿素、6,mol/L,盐酸胍、有机溶剂和去垢剂所改变，其溶解性及功能性也可被变性剂所改变。,蛋白质分析的重要性,(1)生物活性测定 一些蛋白质包括酶或酶抑制因子和食品科学与营养有关，例如肉类嫩化中的蛋白酶、水果成熟中的果胶酶以及豆类中的胰蛋白酶抑制因子都是蛋白质。,(2)功能性质调查 不同种类食品中的蛋白质都有其独特的食品功能性质，例如小麦面粉中的麦醇溶蛋白和麦谷蛋白具有成面团性，牛乳中的酪蛋白在干酪制作中具有凝结作用，而鸡蛋卵清蛋白具有起泡能力。,(3)营养标签,总蛋白质含量；,氨基酸组成；,混合物中的特定蛋白质的含量；,蛋白质分离纯化过程中的蛋白质含量；,非蛋白氮；,蛋白质的营养价值(消化率、蛋白质功效比或氮平衡)。,食品中蛋白质的含量,食品种类,蛋白质的百分含量,食品种类,蛋白质的百分含量,大米(糙米),大米(白米),小麦粉(整粒),玉米粉(整粒),意大利面条,玉米淀粉,7.9,7.1,13.7,6.9,12.8,0.3,大豆(成熟、生）,豆(腰子状、生)豆腐(生、坚硬)豆腐(生、普通),36.5,23.6,15.8,8.1,乳制品,牛乳(全脂，液体),牛乳(脱脂、干),切达干酪,酸奶(普通的、低脂),水果和蔬菜,苹果(生、带皮),芦笋(生),草莓(生),莴苣(冰、生),土豆(整粒、肉和皮),3.3,36.2,24.9,5.3,0.2,2.3,0.6,1.0,2.1,肉、家禽、鱼,牛肉(颈肉、烤前腿),牛肉(腌制、干牛肉),鸡(可供煎炸的鸡胸肉、生),火腿(切片、普通的),鸡蛋(生、全蛋),鱼(太平洋鳕鱼、生),鱼(金枪鱼、白色、罐装、油浸、滴干的固体),18.5,29.1,23.1,17.6,12.5,17.9,26.5,氮是存在于蛋白质中的特征元素，不同食品中蛋白质的含量相关很大。,由于一些食品的组分具有相似的物化性质而使得对蛋白质的分析变得非常复杂。,非蛋白氮可能来自于游离氨基酸、小肽核酸、磷脂、氨基糖、嘌呤以及某些维生素、生物碱、尿酸、脲和氨基离子，因此，食品中的总有机氮主要来自于蛋白质，小部分来自于非蛋白质组分的有机氮。,食品中的脂类和碳水化合物等成分可能会干扰食品蛋白质的分析。,目前，已建立和完善了大量测定蛋白质的方法。这些方法的基本原理包括利用蛋白质的氮、肽键、芳香族氨基酸和紫外吸收性质以及游离基、光散射性质和染色结合能力。即：,一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；,另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。,常用的方法为凯氏定氮法（粗蛋白质测定）,此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法、,NIR,法等也常用于蛋白质含量测定，因其方法简便快速，多用于生产单位质量控制分析。,氮基酸总量测定通常采用酸碱滴定法，目前,HPLC、,氮基酸分析仪也已得到广泛使用。,2,蛋白质的测定,一、常量凯氏定氮法,1 原理 样品中的,蛋白质,和其他有机成分在催化剂存在下，被,硫酸消化,，总有机氮转化成,硫酸铵,，在碱性条件下转化为,氨,，通过水蒸汽将氨蒸馏至硼酸溶液中形成,硼酸铵,，用,标准酸溶液滴定,，测出样品转化后的,氮含量,。由于非蛋白组分中也含有氮，所以此方法的分析结果为样品中的,粗蛋白含量,。,2,NH,2,(,CH,2,),2,COOH,13,H,2,SO,4,(NH,4,),2,SO,4,+6,CO,2,12,SO,2,16,H,2,O,2,NaOH,(NH,4,),2,SO,4,2NH,3,+,Na,2,SO,4,+2,H,2,O,2NH,3,+,H,3,BO,3,(NH,4,),2,B,4,O,7,+5,H,2,O,(NH,4,),2,B,4,O,7,+5,H,2,O,+2,HCl2NH,4,Cl,+4,H,3,BO,3,2 主要仪器,3 测定方法,（1）消化,（2）蒸馏,（3）滴定,4 结果计算,蛋白质含氮量%,换算系数,蛋白质含氮量%,换算系数,蛋或肉,16.0,6.25,燕麦,17.15,5.83,牛乳,15.7,6.38,大豆,17.51,5.71,小麦,17.54,5.70,大米,16.81,5.75,玉米,16.0,6.25,花生,18.32,5.46,二、微量凯氏定氮法,1 测定原理同凯氏定氮法,2 主要仪器,蛋白质测定仪,3 测定方法,（1）样品处理,精密称样（约相当氮3040,mg）,100,ml,定氮瓶,固体样品0.22.0,g,半固体样品25,g,液体样品吸取1020,ml,加入催化剂、硫酸,0.2,g,硫酸铜，3,g,硫酸钾、20,ml(,一般用5,ml),硫酸，,硒催化剂1,g、,5,ml,硫酸,小心加热，至无泡沫产生,大火消化，至液体呈蓝绿色澄清透明，再继续加热0.5,h。,取下放冷，小心加20,ml,水。转移至100,ml,容量瓶中，加水定容。,取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。,（2）按装定氮装置,水蒸气发生瓶内装水至约,2/3处,，加甲基红指示液数滴及,数毫升硫酸,，加入数粒玻璃珠以防暴沸；,加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。,（3）蒸馏吸收,接收瓶内加入10,ml(,一般用30,ml,)2%,硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下；,吸取10.0,ml,样品消化稀释液由小玻杯流入反应室，并以,10,ml,水洗涤,小玻杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。,将,10,ml 40%,氢氧化钠,溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。,夹紧螺旋夹，开始蒸馏。,蒸馏5,min，,移动接受瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1,min。,然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。,半微量凯氏定氮蒸馏装置,（4）滴定,取下接收瓶，以0.05000,mol/L（,一般用0.01000,mol/L,）,盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。同时吸取10.0,ml,试剂空白消化液作空白试验,5 结果计算,X,样品中蛋白质的含量，%；,V,1,样品消耗盐酸标准液的体积，,ml；V,2,试剂空白消耗盐酸标准液的体积，,ml；N,盐酸标准溶液的当量浓度；0.014,1,mol/L,盐酸标准溶液1,ml,相当于氮克数；,m,样品的质量(体积)，,g(ml)；F,氮换算为蛋白质的系数。,优点,可用于所有食品的蛋白质分析中；,操作相对比较简单；,实验费用较低；,结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法；,用改进方法(微量凯氏定氮法)可测定样品中微量的蛋白质。,缺点,最终测定的是总有机氮，而不只是蛋白质氮；,实验时间长(至少需要2,h,才能完成)；,精度差，精度低于双缩脲法；,所用试剂有腐蚀性。,三、双缩脲法,1原理,在,碱性条件,下，,铜离子,和,多肽,(至少有两个肽键，如双缩脲、多肽和所有的蛋白质)生成的复合物呈,紫红色,，吸收波长为560,nm，,比色所得的吸光度值和样品中蛋白质的含量成正比。,2测定方法,(1)5,mL,双缩脲试剂和,1mL,蛋白质溶液(110,mg,蛋白质,mL),混匀。试剂包括硫酸铜、氢氧化钠和酒石酸钾钠以及稳定在碱性溶液中的铜离子；,(2)混合液在室温下放置15,min,或30,min，,然后在560,nm,处比色，读取吸光度值，并扣去空白；,(3)如果反应液不澄清，在测定吸光度前可过滤或离心；,(4)用,牛血清白蛋白(,BSA),建立蛋白质浓度与吸光度的,标准曲线,。,双缩脲法优点,该方法比凯氏定氮法费用低，速度快(可在不到30,min,的时间内完成)，是分析蛋白质最简单的方法；,比福林酚法、紫外吸收法或比浊法更少发生颜色偏离；,几乎没有物质干扰食品中蛋白质的双缩脲反应；,不需要测定非多肽或非蛋白质来源的氮。,缺点,不如福林酚法灵敏，分析时至少需要24,mg,蛋白质；,如果存在胆汁素，则吸光度会虚假增加；,高浓度的胺盐会干扰反应；,不同蛋白质其最终反应产物的颜色不同，如明胶的双缩脲反应产生红紫色；,如果有高浓度的脂或碳水化合物存在时，最终的反应溶液中可能会呈乳白色；,此方法不是一个测量绝对值的方法，必须用已知浓度的蛋白质(如,BSA),或经凯氏定氮法校正。,（四）乙酰丙酮比色法（,GB/T 5009.5-2003,第二法,）,3,氨基酸的测定,一、茚三酮比色法,1.原理,氨基酸在碱性条件下与茚三酮作用生成蓝紫色化合物，其颜色深浅与氨基酸含量成正比，测定反应物的吸光度（,570nm,）,可计算出样品中氨基酸含量。,2.试剂,2%茚三酮,pH8.04,磷酸缓冲溶液,氨基酸标准溶液,3.仪器,分光光度计,4.测定方法,（1）样品处理,称样加水、活性炭加热提取过滤滤液定容,（2）标准曲线制备与样品测定,标准溶液(200,g/mL),样液,标准或样液体积,ml,0.0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,2.0,加入25,mL,比色管，加水至4.0,ml,加1,mL,茚三酮,水浴加热15,min,迅速冷却，定容至25,mL，,静置15,min,测定吸光度（,570nm,),0,A,1,A,2,A,3,A,4,A,5,A,i,5.结果计算,二、氨基酸自动分析仪法,1.原理,食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。,2.试剂,3.,仪器,4.测定方法,（1）,样品处理,匀浆、称样,（2）水解,（3）测定,5.结果计算,