细胞迁移和侵袭实验技术

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,肿瘤细胞运动实验技术,肿瘤细胞生物学实验室 张宁,PI,组,体内实验：,皮下移植瘤模型,原位移植瘤模型,肿瘤细胞运动,体外实验,肿瘤细胞运动,常用研究方法,Text,in here,侵袭实验,趋化运动,划痕实验,实验原理,细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的影响。,划痕实验（伤口愈合实验，,Scratch Assay,）,操作步骤,1,先用,marker,笔在,6,孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔,0.51cm,一道，横穿过孔。每孔至少穿过,3,条线。,操作步骤,2.,在孔中加入约,510,5,个细胞，具体数量因细胞种类不同而不同，接种原则为过夜后融合率达到,100%,；,3.,用,10,m,l tip,枪头用力均匀地在培养皿中划痕，,PBS,洗涤,2,次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。,操作步骤,4,放入,37,5%,CO,2,培养箱培养。每,3h,测量一次细胞运动的距离，拍照,(,具体时间依实验需要而定,),。,操作步骤,5.,数据处理：每个时间点的距离长度,-0,时距离,=,每个时间长度细胞整体迁移的距离，求出均数和标准差，时间为横轴，迁移距离为纵轴（单位,mm,）作图，并比较初始,0,时与实验结束时实验组与对照组的照片。,注意事项,1,.,在用,PBS,缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。,2.,一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（,2%,）否则细胞增殖就不能忽略。,3.,按照,6,孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。,4.,实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度。对不同的细胞要观察细胞的贴壁率等，确定实验时细胞的接种数量和培养时间，保证培养终止时密度适当。,实验原理,趋化运动是指细胞能够感受到外界化学物质的浓度梯度，并沿着浓度梯度的方向所做的定向运动。趋化运动是一个非常保守的过程，对于生物体的生存、生命的繁衍等具有重要的意义。,趋化运动实验（,Chemotaxis Assay,）,微孔小室中的趋化实验,微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞，中性粒细胞或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的滤膜而设计的。,滤膜（聚碳酸脂膜）将小室分隔成上下两部分。靶细胞在上面，趋化因子在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下面，计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。,Boyden Chamber,装置,实验步骤,1.,在冰盒内将趋化因子由高浓度向低浓度稀释，将不同浓度的趋化因子置于趋化小室的下室，,30,m,l/,孔，每个浓度加,3,个孔，其中只加,BM,的孔为阴性对照；,2.,取对数生长期细胞，,0.1%BM,重悬细胞，调整细胞浓度为,510,5,/ml,；,3.,加样：下室加不同浓度的趋化因子，将膜轻轻对折后展平，光面朝下毛面朝上，依次盖上胶垫和上室将螺丝对称拧上拧紧,;,在上室中加入细胞，,50,m,l/,孔，每个浓度加,3,个孔；,实验步骤,4.,将趋化小室在,37,，,5% CO,2,的孵化箱中孵育,3h,；,5.,在膜的两端加上夹子，毛面在,PBS,液面上蘸取，光面禁止碰到液体。毛面在架子上摩擦，再蘸取,PBS,，反复,3,次后再蘸取一次，晾干；,6.,固定,染色,实验步骤,7.,取载玻片，剪角放在右上角，滴一滴石蜡，盖玻片封片；,8.,显微镜观察计数，每孔至少,3,个随机视野，,3,个孔的数值取平均值,;,作柱状图，纵轴趋化指数或细胞数，横轴组别；,9.,趋化指数,(Chemotaxis Index)=,随着趋化诱导因子的浓度梯度而迁移的细胞数目,/,用培养基做对照的迁移细胞数目,注意事项,1.,膜，胶垫，上下小室之间防止有气泡产生；,2.,放膜时要对准位置，过多调整位置，易发生交叉污染。,3.,枪垂直，枪尖伸入孔中下大概,4/5,处，迅速加样，不要迟疑，打出液体的过程枪逐渐抬起，液体全部打出时枪尖离开液面。,4.,洗膜时注意，不要把细胞面与非细胞面弄反。,肿瘤细胞侵袭试验,Matrigel Invassion Assay,Transwell,系统,Transwell,小室,0.4um,孔径聚碳,酯膜的扫描电镜,原理,人工重构基底膜材料,Matrigel,，是一种细胞外基质，,4,时是液体，在,37,会逐渐凝固成胶状。主要成分为层黏连蛋白和,型胶原，能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。,滤膜孔径一般为,8,m,m,，而且膜孔都被,Matrigel,覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有,Martrigel,的滤膜，这与体内情况较为相似。,原理,Transwell,电镜图片,实验步骤及注意事项,1.,无菌条件下,Matrigel,于冰浴融化，用,PBS,（或,DMEM only,培养基）稀释成,1mg/ml,浓度，,-20C,冻存备用；,2.,取出已稀释好的,Matrigel,，冰浴融化，以,50,m,l,的体积铺于,Tramwell,小室（,24,孔板）聚碳酸酯膜上（注意：体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），,37C,放置,lh,，使,Matrigel,聚合成凝胶（注意：加基质胶时最好将,24,孔板放置在冰盒上，确保胶完全覆盖孔底，不要有气泡）；,3.,每孔加入,200,m,l 1640,（或,DMEM,）培养基使胶重构；,4.,在,Transwell,下室中加入趋化因子或,10%FBS,培养基,600,m,l/,孔；,5.,在上室孔中准确加入细胞,l10,5,个,/,孔，细胞悬液体积,200,m,l,，置于,5%CO,2,培养箱于,37C,培养,24h,（,注意：细胞量和时间根据实验条件摸索,）；,6.,待培养时间结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签擦去膜上未穿过膜的细胞；,实验步骤及注意事项,Transwell,小室,上层培养液,细胞,基质胶,下层培养液, 细胞培养板,Transwell,侵袭实验 示意图,7. 4%,中性甲醛固定,10,分钟，,Giemsa,染色,10,分钟，,PBS,洗涤,3,次，干燥，取下微孔滤膜，倒置显微镜下直接观察穿过膜的细胞,(200),；,8.,每张膜中央部分和周围部分各随机取,3,个视野，计数每个视野内的穿过,8,m,m,微孔的细胞数。,实验步骤及注意事项,实验结果举例,