生化分离工程实验

,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,生化分离工程实验,指导老师：何 进 教 授,电子邮箱：,联系电话：,助教学生：,赵有文,刘 舒,胡轶敏,危雅乐,1,组,李佳佳（组长）,董奇峰 吴婷婷 杨后召,2,组,范文瑾（组长）,谢贻天 熊雅琪 罗文,3,组,刘小翠（组长）,张箐 郑琦 孟庆,4,组,罗云超（组长）,刘浩宇 黄玮 李智,5,组,唐清（组长）,李斌 严楠峰 柴芝培,6,组,白腾龙（组长）,伍良伟 余乐 裴媛筠,7,组,邹铮铮（组长）,刘娟 尹学琳 王海云,8,组,赵鹏（组长）,张灵芬 潘丽娜 余晓岚,菌株的优化培养,总,DNA,或,RNA,的抽提,PCR,或,RT-PCR,扩增目的基因,乙醇沉淀回收线性化片断,大肠杆菌表达载体,pET-28,酶连产物转化,E.coli,DH5,挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒,(PCR,及酶切验证,),检索感兴趣的基因（,hfq/fabz,）,直接优化并合成,连,T,载测序,重组表达质粒转化,E.coli,BL21,挑取重组子,用菌落,PCR,方法验证,IPTG,诱导促使目的大量蛋白表达,细胞破碎及蛋白抽提,目标蛋白的纯化,蛋白质浓度测定,-Bradford,法,目标蛋白的鉴定,Western biotting,结晶,结构解析,本次试验内容,本次试验的主要内容,His-Tag,系统,pMAL,系统,无细胞体系,目的基因的背景资料,Hfq,fabZ,Hfq是一个高度保守的RNA结合蛋白，最初被发现是作为大肠杆菌RNA噬菌体Q复制所必需的管家因子。现在则被认为是细菌基因转录后调控的关键因子，广泛参与细菌多种生命活动的调控,。,大肠杆菌,fabZ,基因编码,3-,羟基脂酰,ACP,脱水酶，是大肠杆菌中的必须基因，该基因的突变会导致细菌细胞的死亡。,生化分离工程实验（星期五）,一，接种,按,1%,的接种量将两种菌株分别加入到含抗生素的,LB,培养基中,做好标记（,写清组号，菌株信息、抗性,），统一放于第八组台面。,系统,His-Tag,系统,pMAL,系统,菌株编号,HAZ,JH022,宿主菌,大肠杆菌,BL21,大肠杆菌,DH5,目的基因,hfq,fabZ,培养基,LB,培养基,LB,培养基,接种量,1%,（,2 ml,）,1%,（,2 ml,）,加入抗生素,Kan,（,200 ul,）,Amp,（,200 ul,),生化分离工程实验（星期五）,将超净台内,PA,瓶中剩余的菌液用枪吸取,200 l,于,1.5 ml,离心管中，,10000,rpm/min,离心,1 min,，弃上清，加入,200 l,的无菌水洗涤菌体上残留的培养基,10000,rpm/min,离心,1 min,，弃上清，,然后,重悬于,40,l,灭过菌的去离子水中，,100,煮15 min,，,10000,rpm/min,离心,1 min,，取上清,9.2 l,作为菌落,PCR,的模板。,二，菌液,PCR,（验证目的基因已转入宿主菌中,）,PCR,体系,H,2,O 9.2 l,10 X PCR buffer,2.5 l,dNTP 2 .0 l,上游引物,0.5 l,下游引物,0.5 l,Taq,酶,0.3 l,模板,10 l,总体积,25 l,PCR,程序,95, 5 min,95 35 s,56 40 s,72 60 s,72 10 min,25 10 min,Cycle 30,注：用质粒做阳性对照，水做阴性对照，不用重复，,PCR,管上做好标记,！,The pMAL-c2 series of vectors have an exact deletion of the,malE,signal,sequence, resulting in cytoplasmic expression of the fusion protein. The,pMAL-p2 series of vectors contain the normal,malE,signal sequence, which directs the fusion protein through the cytoplasmic membrane, and the fusion proteins can be exported to the periplasm,表达系统,His-Tag,pMAL,菌株,HAZ,JH022,培养温度,37,37,转速,200 rpm/min,200 rpm/min,适宜状态,OD,600,=0.6,OD,600,=0.5,所需时间,2.5 h,2.5 h,加入,IPTG,的终浓度,1.0 mM,(2 ml),0.3 mM,(0.6 ml),三，诱导,注：在加入,IPTG,之前，摇匀菌液并各取,1 ml,于,1.5 ml,的离心管中，做好标记（组号，菌液名）记作“,诱导前,”，放于第八组桌面的离心管板中，于,20 ,保存。,四，配试剂,五，,PCR,结果,依据每组发的纸条进行,生化分离工程实验（星期五）,将加入诱导剂后的菌液再放入,37 200 rpm/min,的摇床中诱导培养,4-5,小时,后收集菌体。,菌株,HAZ,JH022,沉淀,（离心管对应配平）,8000 rpm/mim,离心,5 min,8000 rpm/mim,离心,5 min,收菌,弃上清，沉淀用,10ml binding buffer,重悬,弃上清，沉淀用,10ml column buffer,重悬,保存,20,20,注：在离心沉淀之前摇匀菌液取,1 ml,于,1.5 ml,的离心管中，做好标记（组号，菌液名）记作“,诱导后,” 放在第八组的离心管板上。,离心时用天平严格配平，沉淀重悬后做好标记放于第八组桌面上！,六，收菌,组氨酸和,Ni-NTA,imidazole,亲和作用原理,6His/Ni-NTA,亲和纯化步骤,系统原理示意图,pMAL,Ni柱的清洗与保存,用水洗,3,次（去掉保存的,20%,乙醇）,充电（装满,NiSO4,，温和摇动后自然沉降）,洗涤（,3,次水洗，去掉游离的,Ni),平衡（,2,次的,binding buffer,洗）,1,2,3,4,HisTag,蛋白质的纯化步骤,上样（每次,15ml,，样品要与柱子充分结合,）,加,washing buffer,（用,100%TCA,检测不出沉淀为止）,加,Elution buffer,（一般收集,8ml,）,重复第,48,步,5,6,7,8,第,1,步：,2,倍体积,6 M,盐酸胍，,0.2 M,醋酸,第,2,步：,2,倍体积水,第,3,步：,1,倍体积,2% SDS,（注意低温容易析出）,第,4,步：,1,倍体积,25%,乙醇,第,5,步：,1,倍体积,50%,乙醇,第,6,步：,1,倍体积,75%,乙醇,第,7,步：,5,倍体积,100%,乙醇,第,8,步：,1,倍体积,75%,乙醇,第,9,步：,1,倍体积,50%,乙醇,第,10,步：,1,倍体积,25%,乙醇,第,11,步：,1,倍体积水,第,12,步：,5,倍体积,100 mM EDTA,，,pH8.0,第,13,步：,3,倍体积水,由于,EDTA,处理后仍可有少量蛋白未能完全释放，建议在纯化不同蛋白时应另换,HisBind,树脂。,树脂的再生,当柱流速明显下降，或树脂在使用离子化缓冲液处理之后没能显示深蓝绿色，则树脂需要更彻底的清洗处理。,直链淀粉柱的再生,水,3,倍柱体积,0.1%SDS,3,倍柱体积,水,1,倍柱体积,Column buffer,3,倍柱体积,生化分离工程实验（星期六）,一、裂解细胞,将冷冻保存的细胞团在室温下解冻，冰上破碎至菌液成澄清（,200-300w,超声,610s-10s,，约,20 min,）,天平严格配平后,10000*g,，,4,，离心,20 min,。上清取,1 ml,于,1.5 ml,离心管中，作标记为“,上清,”，沉淀用,1 ml,对应的,buffer,（,his-tag,为,binding buffer,，,pMAL,为,column buffer,）重悬后，保存在,1.5 ml,的离心管中，标记为“,沉淀,”，做好组号和菌株标记后，放于第八组台面。,二，蛋白纯化,系统,His-Tag,系统,pMAL,系统,柱子类型,Ni-NTA,柱,支链淀粉柱,操作方法,3,次,binding buffer,平衡,3,次,column buffer,平衡,堵住下端后上样（,10ml,）静止,5 min,，盛接流出液后再上样，重复三次,上样（,10 ml,）静止,5min,，盛接流出液后再上样，重复三次,收集最后一次穿透液，取,1 ml,于,1.5 ml,离心管中，标记“穿透”,收集最后一次穿透液，取,1 ml,于,1.5 ml,离心管中，标记“穿透”,6,次,wash buffer,水洗,Column buffer+10mM,麦芽糖的溶液洗涤（每加,1 ml,用,1.5 ml,离心管收集,),共收集,7,管，做好标记,Elution buffer,洗涤（每加,1 ml,用,1.5 ml,离心管收集,),共收集,7,管，并做好标记,系统,His-Tag,系统,pMAL,系统,操作步骤,Elution buffer,洗涤,2,次,buffer+10mM,麦芽糖的溶液洗涤,2,次,加入,20%,乙醇保存,加入,20%,乙醇保存,后续反应,酶切去除标签,注：收集到的蛋白做好标记后须在冰上保存，避免其失活,pMAL,系统,MBP,标签的切除,从,A595,最大的几管,(,一般是第一、二管,),取,100 l,用于蛋白酶,FactorXa,的酶解，在,100 l,洗脱液中取,15 ul,保存在,pcr,管中，作为酶切对照，剩下的加入,2 ul,的,FactorXa,后置于摇床上震荡反应，室温下反应,18 h,，分别于第,1h,、,3 h,、,6 h,、,17 h,取样,15 l,。,三，,SDSPAGE,样品的制备,将收集到的,14,管,目的蛋白和之前保存的 “上清”“沉淀”“穿透”（,共,6,管,）蛋白各取出,20 ul,于对应的已经标记的,1.5 ml,离心管中，加入,20 ul SDS-PAGE loading buffer,，将先前保存的“诱导前”“诱导后”（,共,4,管,）于,10000rpm/min,离心,1min,，弃上清，沉淀用,15ul,对应的,buffer,重悬，再加入,15ul SDS-PAGE loading buffer,，沸水浴,15 min,后，放于第八组台面。,无细胞体系,生化分离工程实验（星期六）,四，,Bradford protein assay,1,、标准曲线的制作,（,1,）标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白（,BSA),配置成,1.0mg/ml,的标准蛋白质溶液。,（,2,）考马斯亮蓝,G-250,染料试剂：称,100mg,考马斯亮蓝,G-250,溶于,50 ml 95%,的乙醇后，再加入,120 ml 85%,的磷酸，用蒸馏水稀释至,1 L,。,管号,1,2,3,4,5,6,7,标准蛋白质（,ml,）,0,0.01,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,蒸馏水（,ml,）,0.1,0.09,0.08,0.06,0.04,0.02,0,考马斯亮蓝,G-250,试剂（,ml,）,5,5,5,5,5,5,5,A,595,每加完一管立即在漩涡振荡器上混合，,25 min,后以,1,号为对照调零测,A,595,以标准蛋白质量（,ug,）为横坐标，用吸光度,A,595,为纵坐标作标曲,注,;,震荡过程中不要太剧烈，以免产生较多气泡而无法消除,管号,1,2,3,4,5,6,7,HAZ,和,Fabz(ml,）,0.05,0.05,0.05,0.05,0.05,0.05,0.05,蒸馏水（,ml,）,0.05,0.05,0.05,0.05,0.05,0.05,0.05,考马斯亮蓝,G-250,试剂（,ml,）,5,5,5,5,5,5,5,HAZ A595,Fabz,A595,五，未知蛋白浓度的测定,将保存的纯化的蛋白各取,50 ul,，加,50 ul,蒸馏水后再加入,5 ml,考马斯亮蓝,G-250,染液试剂，漩涡震荡后静止,25 min,，以,0.1 ml,水加,5.0 ml,的,G-250,试剂调零，测其在,595nm,处的吸光度。,生化分离工程实验（星期六）,六，,配制,SDS-PAGE,试剂,分离胶（,12%),浓缩胶,(5%),ddH,2,O,9.0 ml,5.0 ml,40%,丙烯酰胺,6 ml,1.0 ml,分离胶,-buffer,5.0 ml,不加,浓缩胶,-buffer,不加,2 ml,10%APS,100,l,60,l,TEMED,20,l,20,l,总体积,20 ml,8 ml,每组配两块，均采用,15,孔梳子,注：在配胶前注意梳子厚度（,1.0mm,和,1.5mm,）与胶板厚度的一致性,生化分离工程实验（星期天）,跑,SDS-PAGE,点样：所有的样品和蛋白,Marker,点样前都要沸水浴,5,分钟使蛋白质完全变性。一般的点样量为,10-20 ul,。,(,记录点样顺序,),点样完毕后即可开始电泳，先以,80,伏电压跑,15-20,分钟，蛋白质通过积层胶后，更换到,120,伏，待溴酚蓝接近分离胶底部后停止电泳，取下胶板，小心撬开胶板割取分离胶，放入染色皿中，加入一定染色液（没过胶面即可）。置于摇床上染色,3,小时左右。,染色完毕后，回收染色液，加入脱色液，摇床脱色数次，最后一次可以过夜脱色。,SDS-PAGE的原理,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺,(Acr),和交联剂,N,，,N,亚甲基双丙烯酰胺（,Bis,）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,（,PAGE),阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠,SDS,打断蛋白质的氢键和疏水键,，包裹蛋白,根据蛋白所带电荷差异和分子大小不同来分离,掩盖电荷差异和形状区别，而只与分子量有关,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳,引发剂是过硫酸铵,(AP),，催化剂,N,、,N,、,N,、,N,四甲基乙二胺（,TEMED,），它的碱基催化,AP,产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；,不连续系统：缓冲液离子成分，,pH,，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳,本实验采用垂直板状不连续系统。所谓,“,不连续,”,是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、,pH,和凝胶孔径等所组成。,浓缩效应,和,分子筛效应,