PCR扩增目的基因

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,任务二：PCR扩增目的基因,一、实验目的,1、掌握PCR扩增DNA的技术与原理,2、学习PCR扩增仪的使用,二、实验原理,聚合酶链式反应是一种体外DNA扩增技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等特点。,PCR工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片段和与其两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增序列片段的特异性和片段长度。,标准的PCR过程分为三步：,1.模板变性（92-96）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA,2.低温退火（37-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。,3.延伸（72）：在Taq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3 端延伸，合成与模板互补的DNA链。,三、实验仪器,PCR扩增仪,台式高速离心机,移液器,高压灭菌后的Eppendorf管（,0.5mL,）,电泳仪,四、材料与试剂,1、模板DNA（0.1g/L）：用牙签挑取单 菌落悬浮到50L的裂解液中（1%TritonX-100，20mmol/LTris-HCLpH8.2，2mmol/L EDTA），95温浴10min，10000r/min,离心5min，取2L上清液用于总体积50L的PCR反应。,2、TaqDNA聚合酶（5U/L），10扩增,缓冲液，dNTP（1mmol/L）：购买。,3、引物（100pmol/L）：设计并合成与目的DNA两侧互补的引物。,五、实验操作,1.准备PCR反应溶液,（1）按序将如下成分混合置于Eppendorf管内,a.10扩增缓冲液 10L,b.4dNTPs 8L,c.引物11L,d.引物2L,e.模板DNA 1L（10ng）,f.TaqDNA聚合酶L,（2.5U）,加水至,终,100L,（2）手指轻弹Eppendorf管底部,离心2s,（3）加石蜡油50L封住溶液表面,2.PCR扩增反应,加好样的Eppendorf管置于PCR扩增仪内,变性：95 5min 951min,退火：55 45s,延伸：72 1min,重复循环30次,循环结束后72 延伸8min,反应完毕，取样置-4 待用,3.结果观察,取样进行琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭,（EB）染色,观察DNA条带,高度灵敏的荧光染色剂,染色效果好,操作方便,稳定性差,强致癌剂,中度毒性,六、注意事项,1、PCR结果若出现非特异性的扩增条带，有 必要进一步优化反应条件，包括改变退火 温度和时间，调整Mg,2+,浓度等。,2、PCR反应特异性强，引物浓度、TaqDNA聚合酶和dNTP的量不宜过多。,3、引物设计要合理。,Thank you!,再 见！,