人教版教学课件基因工程的基本操作步骤

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,基因工程的基本操作程序,专题基因工程,基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,1.基因工程的操作步骤正确的操作顺序是,使目的基因与运载体相结合将目的基因导入受体细胞,检测目的基因的表达是否符合特定性状要求,提取目的基因,A B,C D,步骤一：,目的基因的获取,目的基因是人们所,需要转移,或,改造,的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步。,如苏云金芽孢杆菌的,抗虫基因,，还有植物的,抗病,（,抗病毒,、,抗细菌,）,基因,、种子,贮藏蛋白的基因,，以及人的,胰岛素基因,、,干扰素基因,等。,目的基因的提取方法,人工合成基因,反转录法,根据已知的氨基酸序列,合成DNA,：,鸟枪法,直接分离基因,从基因文库中获取,基因组文库,cDNA文库,1.,鸟枪法（散弹射击法）,用,限制酶,将,供体细胞,中的,DNA切成许多片段,，从中,找出含有目的基因,.,用限制酶切断成许多片段,1）,反转录法,：,以,目的基因,转录成的,信使RNA,为模板，,反转录,成互补的,单链DNA,，然后在酶的作用下,合成双链DNA,，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA(cDNA),双链DNA,(即目的基因),反转录,合成,2.人工合成基因法,2）,根据已知的氨基酸序列合成DNA法,：,根据,已知,蛋白质的,氨基酸序列,，,推测,出相应的,信使RNA,序列，然后按照,碱基互补配对,原则，,推测,出它的,结构基因的核苷酸序列,，再通过化学方法，以,单核苷酸为原料合成目的基因,。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？,优点,缺点,鸟枪法,反转录法,根据已知氨基酸合成DNA法,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，,mRNA,很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？,1）DNA序列自动测序仪：,2）PCR技术：,对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。,3从基因文库中获取目的基因：,基因文库:,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library),基因组文库:,基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.,部分基因文库:,基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.,用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特定的限制性内切酶切割成一个个片段，然后将这些片段随机地连接在某些质粒或其他载体上，再将它们转移到适当的宿主细胞中，通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这些克隆多到可以包括某种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。这一定义也适用于线粒体DNA和叶绿体DNA，分别称为某种生物的线粒体基因文库或叶绿体基因文库。为了有效地保存基因文库，可通过细菌在固体培养基上繁殖而使包含各个特定DNA片段的细菌增多。通过分子杂交的方法，可以筛选出包含有所需基因的DNA片段的细菌（或噬菌体）。经过扩增得到大量这样的细菌（或噬菌体），从中便可分离出所需基因的DNA片段。建立和使用基因文库是分离高等真核生物基因的有效手段，对于基因定位和基因工程的研究都很有用。,步骤二：,基因表达载体的构建,1）用一定的,限制酶切割质粒,，使其出现,一个切口,，露出,黏性末端,。,2）用,同一种,限制酶,切断目的基因,，使其产生,相同,的,黏性末端,。,3）将切下的目的基因片段,插入质粒,的切口处，再加入适量,DNA连接酶,，形成了一个,重组DNA分子,（重组质粒）,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的,基因重组的过程,。,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴,细菌或病毒侵染细胞,的途径。,步骤三：目的基因导入受体细胞,直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等方法。,（1）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。,（2）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。,（3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。,（4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。,间接导入法常用的载体是质粒、噬菌体、科斯质粒。,（1）质粒是细菌染色体DNA以外的环状双链DNA分子，它能自我复制，也可整合到细胞染色体DNA中与其一起表达。质粒通常还含有标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。,（2）噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链DNA可以作为目的基因的载体。,（3）科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和噬菌体的部分顺序，很适合用作真核生物基因的载体。,1.将目的基因导入植物细胞,2.将目的基因导入动物细胞,3.将目的基因导入微生物细胞,大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:,首先用Ca,2+,处理细胞,以,增大,细菌,细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.,第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.,第二步,目的基因在受体细胞内，随其繁殖而,复制,，由于细菌,繁殖的速度,非常快，在很短的时间内就能获得,大量,的目的基因。,1）将细菌用,CaCl,2,处理,，以,增大,细菌,细胞壁的通透性,。,2）使含有目的基因的,重组质粒进入,受体细胞。,3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而,复制,，由于细菌,繁殖的速度,非常快，在很短的时间内就能获得,大量,的目的基因。,步骤四：目的基因的检测与鉴定,四环素,抗性基因,氨苄青霉,素抗性基因,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了,表达,。,受体细胞摄入,DNA,分子后就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行,修饰,。,前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。,无表达产物,无表达产物,有表达产物,无表达产物,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,1）以下说法正确的是 （）,A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,B、质粒是基因工程中唯一的运载体,C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接,D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是,A、能复制,（）,B、有多个限制酶切点,C、具有标记基因,D、它是环状DNA,D,练习,3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）,A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来,B、限制性内切酶用于目的基因的获得,C、目的基因须由运载体导入受体细胞,D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,4）有关基因工程的叙述正确的是 （）,A、限制酶只在获得目的基因时才用,B、重组质粒的形成在细胞内完成,C、质粒都可作为运载体,D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,练习,5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （）,A、人工合成目的基因,B、目的基因与运载体结合,C、将目的基因导入受体细胞,D、目的基因的检测和表达,C,练习,