微生物细胞的破碎

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,15 微生物细胞的破碎,胞内产物，要首先进行细胞破碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。,15 微生物细胞的破碎,一、细胞壁的组成和结构,细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。,（一）、细菌的细胞壁,几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固骨架肽聚糖组成。,G,+,细胞壁结构与,G,-,有很大不同。,破碎细菌的主要阻力是来自于,肽聚糖的网状结构,，其网结构的致密程度和强度取决于肽聚糖上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。,（二）、酵母菌的细胞壁,主要成分：,葡聚糖与甘露聚糖以及蛋白质,等，比革兰氏阳性菌稍厚，面包酵母的细胞壁厚度约为,70 nm，,而且其厚度随菌龄增加而增加。有可能仅有一部分厚度对酵母细胞壁的刚性和强度起重要作用。,结构：,最里层是由,葡聚糖,的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，中间是一层,糖蛋白,，再外面是网状结构的,甘露聚糖,。,破碎阻力主要决定于,壁结构交联的紧密度和壁厚度。,大多数真菌的细胞壁主要由,多糖,组成，其次还含有较少量的,蛋白质和脂类,。不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由,几丁质和葡聚糖,构成。,真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。,（三）、其他真菌的细胞壁,红面包霉菌的细胞壁具有,同心圆层状结构,，主要存在三种聚合物，,葡聚糖，几丁质以及糖蛋白,。,（四）、细胞壁的结构和细胞破碎,破碎时必须克服的主要阻力是,网状结构的共价键,。,细胞的大小和形状以及聚合物的交联程度都是影响破碎难易程度的重要因素。,壁结构不仅取决于,遗传信息,也取决于,生长环境,，真菌的壁结构还随发酵罐中混合的,机械作用,而变化,。,虽然通过,改变遗传密码或环境因素,能够改变细胞壁的结构，但目前没有足够资料表明该法能提高对机械破碎的敏感性，也没有足够的资料能用来顶测各种微生物对机械破碎的相对阻力。,在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞壁的结构和组成显得特别重要，,可用来作为选择溶菌酶和化学方法的依据。,二、微生物细胞的破碎技术,（一）、机械方法,优点：,处理量大，破碎速度较快。,细胞受到由高压产生的高剪切力，与玻璃珠一起的高速搅拌或超声波。,机械法的缺点,:,、,需高能量，产生,高温,和高剪切力，易使产品变性失活,; 需,冷却却措施,。,、,就被破碎的有机体或释放的产物而论，它们是非专一的。,、产生碎片微粒尺寸的大范围细分布，大量细颗粒给分离带来了困难。,A,珠磨机(,Bead mill),研磨,：将细胞悬液与玻璃珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使细胞破碎。,实验室设备：,Mickle,高速组织捣碎机,和,Braun,匀浆器,，利用玻璃小珠撞击微生物细胞而破碎。,主要缺点,：,温度迅速升高，需冷却,。,另外，较大量的细胞可用,胶质磨,来处理。,工业规模：,高速珠磨机,。,圆盘高速旋转，使细胞悬液和玻璃珠相互搅动，细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起。,瑞士：,Dyno Mill。,磨室具夹套，可冷却。在料液的出口处有一旋转的圆盘和出口平板(出口位于平板的中部)很靠近，可防止珠体随料液带出。,典型的珠磨机的构造：,除磨室以夹套冷却外，搅拌轴和圆盘也可以冷却，圆盘交错地装在轴上，一种处于径向，另一种和轴倾斜，径向圆盘使磨料沿径向运动，而倾斜圆盘使产生铀内运动。这种交错的运动，提高了破碎效率。,西德生产的容量为20,L,的,LM20,型珠磨机,。,破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合下列公式：,破碎作用动力学,影响速度常数,K,的因素：,珠体直径，细胞浓度和负荷，料液流速，搅拌器转速和构型，温度等。,不仅影响破碎程度，也影响所需能量。,珠体的大小,应根据细胞大小、浓度以及在连续流动的操作过程中不使珠体带出来选择，珠体在磨室中的装量影响破碎程度和所需能量。,增加,搅拌速度,能提高破碎效率，但过高会使破碎率降低，能耗增大。,操作温度,在540,范围内对破碎物影响较小，但操作过程中，磨室温度很容易升高，较小设备可采用冷却夹套，但大型设备中热量的除去是必需考虑的一个问题。,B,高压均质器,大规模破碎细胞常用，利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破碎。,对酵母菌等难破碎的及浓度高或处于静止期的细胞，常采用,多次循环,。其破碎属于一级反应速度过程，被破碎的细胞分率符合下式公式：,多次循环,影响破碎的主要因素：,压力、温度和通过匀浆器阀的次数。,压力：,升高压力有利于破碎，,Brokman,研究了能适应于高压操作的匀浆器,，,试验表明在约175,MPa,的压力下，破碎率可达100，但是也有试验表明当压力超过一定的值后，破碎率增长得很慢。,工业上常采用,5570,M Pa,。,破碎性能随菌体种类和生长环境的不同而不同,。,Gray,报导生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复合培养基上易破碎。,高压匀浆器中阀门的设计也影响破碎,，阀座呈刀口状比平面阀座破碎效率高。,C. X-Press,法,原理：,将浓缩的菌体悬浮液冷却至25至30,形成冰晶体，利用500,MPa,以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。,此法称为,XPress,法或,Hughes press,法，主要用于实验室中。,影响因素：,高浓度的细胞、低温、高的平均压力能促进破碎。,优缺点：,适用范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低、活性保留率高，但是，该法对冷冻融解敏感的生化物质不适用。,频率超过15-2,0,kHz,的超声波可使悬浮液中微生物细胞失活，在较高的输人功率下，可破碎微生物细胞。,实验表明，在声能高达200声瓦的2,0kHz,声频下，经超声波处理的酿酒酵母的蛋白质释放量在细胞浓度达到600,kg(,湿重)/,m,3,之前，,与细胞浓度无关，而几乎与输入声能成正比。,D.,超声波法,原理：,破碎原理是超声波的,空穴作用,。,在相当高的输入声能下，液体各个成核部位会形成许多小气泡。在声波膨胀相中，这些气泡会增大，而在压缩相中气泡会被压缩，直到不能再压缩时，气泡破裂，释放出猛烈的震波。这种震波通过介质传播。在气泡发生空穴现象的破碎期间，大量声能被转化成弹性波形式的机械能，引起局部的剪切梯度使细胞破碎。,液体对声能的吸收是由总的压力决定的，在达到某一限值之前，提高环境压力可以提高声能对震波能的转化率。,缺点：,温度剧烈上升，需冷却。不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却。,不同菌种、超声波处理的效果不同。,杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌容易破碎，,对酵母菌的效果极差。,超声波破碎时，影响生物产品收率的因素：,1、温度上升,当气泡破裂时，绝大部分释放出来的能都以热的形式为液体所吸收，为了避免高温，悬浮液应预先冷却到05,C，,并且还应用冷却液连续通入容器夹套，即短期的声波破碎与短期的冷却交替操作，,声波破碎/冷却的时间比率称为 “负载因素”。,2、化学效应,超声处理会引起诸如生成,游离基,这样的化学效应，它可能对某些需要的分子带来破坏性影响，但对破碎细胞毫无影响。,可通过添加,游离基清除剂,如胱氨酸或谷胱甘肽，或者用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。,由一个带夹套的烧杯组成，其形状和尺寸会影响悬浮液的流体动力学。对于刚性细胞可以添加细小的珠粒，产生辅助的研磨效应。超声波反应器内，有四根内环管，由于声波振荡能量会泵送悬浮液循环，用插入进出口管到内部烧杯去的方法，就可以实现连续操作。,连续超声波破碎的实验室装置,影响超声波破碎效率的参数:,(1)、振幅,振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速度,k。,(2)、,细胞悬浮液的粘度,粘度影响能耗并会抑制空穴现象。,(3)、表面张力,添加表面活性剂或从细胞中释放出表面活性物质(如蛋白质)，能显著地影响声波破碎效率。,因为强烈起泡在气一液界面上会促使蛋白质变性和空穴清除，特别是应用高的功率时。,(4)、被处理悬浮液的体积,大体积需要高的声能引起强烈涡流和大气泡形成。,(5)、珠粒的体积和直径,添加细小的珠粒，玻璃或者钢制的，不仅对空穴的形成有帮助，而且产生辅助 “研磨”效应，从而提高破碎效率。,在相同珠粒填充密度下，随着珠粒直径的变化，,k,存在最大值。,(6)、探头的形状和材料,对于一个能级恒定的功率，,探头的振幅与其面积成反比,，然而对于小直径的探头，声能限制在较小的区域并且效率低。特别是当悬浮液的体积小的时候，能量在探头嘴附近被悬浮液吸收，强烈的涡流会变小。对于大的探头，声能消耗在大范围上，结果则使振幅更小。,探头嘴通常用,钛,制造，因为钛具有良好的声学和机械特性以及对生物活性产物的低毒性。为了维修和替换，通常探头可以拆卸。除钛以外，还可使用其他材料如,不锈钢或硬质钢,，但是其声学和机械特性都不如钛，破碎速度也大幅度降低。,(7)、细胞悬浮液的流速,在连续操作中，流速取决于细胞在反应器中的停留时间，并影响破碎的总收率。,声波破碎在实验室广泛应用，但在工业范围中还未采用这种方法，因为要向大量细胞悬浮液中通入足够的能量是很困难的。,（二）、非机械方法,酶解,渗透压冲击，,冻结和融化,热处理、,化学法溶胞,原理：,利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁目的。,A.,酶解法,优点:,产品释放的选择性高;,抽提的速率和收率高;,产品的破坏最少;,对,pH,值和温度等外界条件要求低;,不残留细胞碎片。,缺点：,广泛应用受酶的费用限制。若在超滤反应器中使用可溶性固定化酶可望解决酶的费用问题。,单一酶不易降解细胞壁，需要选择适宜的酶及酶反应系统，确定特定的反应条件，并结合其他的处理方法，如辐照、加入高浓度盐及,EDTA，,或利用生物因素促使生物对酶解作用敏感等,如果是酵母细胞的破壁，至少有两种酶是必需的，即,细胞壁溶解蛋白酶,和,(1-3),葡萄糖酶,，但是,(1-6),葡萄糖酶，甘露糖酶,和,甲壳素酶,将加速这一溶解过程。,对于细菌，,糖苷酶、,N,一乙酞胞壁酰-,L,一丙氨酸酰胺酶,和,多肽酶,的混合物将加速肽聚糖的溶解。在破碎革兰氏阴性菌时，为了去除外部双层脂质需要用,表面活性剂,进行预处理。,除上述外，可采用的酶还有其他类型的蛋白酶、脂肪酶、溶菌酶、核酸酶、透明质酸酶等。,应用最多，专一地分解肽聚糖的,1，4,糖苷键，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。,溶菌酶：,原理：,微生物代谢能产生一种能水解细胞壁上聚合结构的酶，以便使生长过程进行下去。可是，改变微生物的环境可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶的目的。,影响因素：,有温度、时间、,pH,缓冲液浓度、细胞代谢途径等。,方法：,微生物自溶常采用,加热法或干燥法,。,B.,自溶法,举例,：,1、谷氨酸产生菌，可加入,0.02,8,molL Na,2,CO,3,和,0.018molL NaHCO,3,，pH10,的缓冲液，使成3的悬浮液，加热至70,C，,保温搅拌20分钟，菌体即自溶。,2、酵母自溶温度需在4550,C,下保持1224小时。,自溶法在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。,采用抑制细胞壁合成的方法能导致类似于酶解的结果。,某些抗生素如,青霉素或环丝氨酸,，能阻止新细胞壁物质的合成。,抑制剂应在发酵过程细胞生长期的后期加入。只有当抑制剂加入后,，,生物合成和再生还在继续进行，溶胞的条件才是有利的。这样在细胞分裂阶段存在的细胞壁有缺陷，故能达到溶胞作用。,此法费用很贵。,C.,抑制细胞壁合成,原理：,渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液）达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。,D.,渗透压冲击,例如，,从大肠杆菌中制备亲水性酶时，首先将细胞用30,mmo1L TrisHCl,缓冲液洗涤。然后，将菌体置于30,mmolL TrisHCl，0.1mmo1L EDTA, pH 7.2,的20%蔗糖溶液中搅动，待菌体内外平衡后离心，菌体在4,C,冷却后，迅速投入冷水中，剧烈搅拌10分钟，即有水溶性酶被释放出来。,渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。,原理：,反复冻结融化法系将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破坏，从而增加了细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞突然膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。,缺点：,但通常破碎率很低，即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。,E.,反复冻结融化,原理：,干燥法可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。它使细胞膜渗透性改变，当用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就容易被抽提出来。,空气干燥,主要适用于酵母菌，一般在2530,的气流中吹干，然后用水、缓冲液或其它溶剂抽提。空气干燥时，部分酵母可能产生自溶，所以较冷冻干燥、喷雾干燥容易抽提。,真空干燥,适用于细菌的干燥。,F.,干燥法,冷冻干燥,适用于较不稳定的生化物质，将冷冻干燥后的菌体在冷冻条件下磨成粉，然后用缓冲液抽提。,有机溶剂脱水,：例如，丙酮等使细胞脱水，即可将菌体悬浮液慢慢倒入,10,倍体积预冷至20,的丙酮中搅拌使之脱水，丙酮除能脱水外，还能溶解除去膜上部分脂肪，所以更容易抽提。,缺点：,干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。,G.,化学法处理,用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分的方法称为化学渗透法。,例如,酸、碱、某些表面活性剂及脂溶性有机溶剂 (如丁醇、丙酮、氯仿等)，,都可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择性地渗透出来。, 、酸碱,用来调节溶液的,pH,值，改变细胞所处的环境，从而改变两性产物 蛋白质的电荷性质，使蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的作用力降低而易于溶解到液相中去，便于后面的提取。, 有机溶剂,常用的是甲苯，它被细胞壁脂质层吸收后会导致胞壁膨胀，最后造成细胞壁的破裂，可处理的菌体有无色杆菌、芽孢杆菌、梭菌、假单胞杆菌等菌体。,但甲苯具有致癌性，一般选用具有与细胞壁中脂质类似的溶解度参数的溶剂作为细胞破碎用的溶剂。,某些,脂溶性溶剂,也能作为化学处理的方法，如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但是，这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来分离和回收化学物质的问题。, 表面活性剂,都是两性化合物，分子中有一个亲水基团和一个疏水基团，在适当的,pH,值和离子强度下，它们凝集在一起形成,微胶束,，疏水基团聚集在胶束内部将溶解的脂蛋白包在中心，而亲水基团则向外层，这样使膜的通透性改变或使之溶解，该法特别适用于,膜结合的酶,的溶解。,表面活性剂有,天然的,(如胆酸盐及磷脂)和,合成的,(阴离子型如十二烷基磺酸钠;非离子型如吐温 (,Tween)，,阳离子型如二乙氨基十六烷基溴)两类。,一般来说离子型的比非离子型更有效，但也容易使蛋白质变性。,典型的例子是用表面活性剂,Triton,(,非离子型)，从一种诺卡氏菌中选择性地提取胆固醇氧化酶。这种表面活性剂比较昂贵并且易污染产物，因此难以大规模应用。,举例：,对于胞内的异淀粉酶，可加入,0.1,十二烷基硫酸钠或,0.4Triton X100,于酶液中作为表面活性剂，30,振荡30,h，,异淀粉酶就能较完全地被抽提出来，所得比活性较机械破碎为高。,任何破壁方法都有局限性和不足，应根据破壁目的、产物的类型和位置，选用合适的方法，达到选择性地分步释放目标产物的要求。,其一般原则为,:,若提取的产物在细胞质内，需用机械破碎法。,若在细胞膜附近则可用较温和的非机械法,。,若提取的产物与细胞膜或壁相结合时，可采用机械法和化学法相结合的方法，以促进产物溶解度的提高或缓和操作条件，但保持产物的释放率不变。,总结,选择破碎方法要考虑的因素：,细胞的数量，产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性，破碎程度及破碎速度，希望尽可能采用最温和的方法。,具有大规模应用潜力的生化产品还要选择适合于放大的破碎技术。, 多种破碎方法相结合。,即机械方法与非机械方法的结合等，如用细胞壁溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，在95,MPa,压力下匀浆4次，总破碎率可接近100% ,而单独高压匀浆法破碎率只有32%, 与下游过程相结合。,必须从后分离过程的整体来考虑破碎操作，即破碎过程要易于细胞碎片的除净;, 与上游过程相结合。,细胞的培养过程及其环境条件对细胞的结构及破碎难易有很大影响。, 用基因工程的方法对菌种进行改造。,如引入溶解酶的基因讯息，以代替机械破碎法也是非常重要的课题。,为解决破碎过程中敏感性物质的失活，杂蛋白太多以及碎片的去除问题，细胞破碎技术研究还应注意以下问题:,除研究破碎细胞的方法外，,还应研究在生物合成过程中减低细胞牢固程度的方法。,例如,，发酵过程中改变条件(温度、培养基或加入抗生素等)使某些细菌缺少合成细胞壁的某种组分，它就会,从杆状细胞变为丝状细胞,，这样就便于用离心分离法收集细胞和进行破碎。,三、破碎率的测定,破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即:,Y(%),(,N。,一,N)/N,0, 100,由于,N,0,(,原始细胞数量)和,N (,经,t,时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量)不能很清楚的确定，因此破碎率的评价非常困难。,目前,N。,和,N,主要通过下面的方法获得。,（一）、,直接测定法,利用显微镜或电子微粒计数器可直接计数完整细胞数，所以可用于破碎前的细胞计量。可是破碎过程中所释放的物质如,DNA,和其他聚合物组分会干扰计数，此时可,采用染色法把破碎的细胞从未损害的完整细胞中区别开，,以便于计数。,例如,，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成阴性菌的颜色，利用,革兰氏染色法,未受损害的酵母细胞呈现紫色，而受损害的酵母细胞呈现亮红色。,（二）、测定释放的蛋白质量或酶的活力,测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。,通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中蛋白质的含量或酶的活力，并与100破碎所获得的标准数值比较；,（三）、测定导电率,导电率的变化是由于细胞内含物被释放到水相中而引起的。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加。,因为导电率的读数取决于微生物的种类、处理的条件、细胞浓度、温度和悬浮液中电解质的含量，因此应预先采用其他方法来进行标化。,本章结束,