NA的粗提取与鉴定

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA的粗提取与鉴定,一、基础知识,（一）提取DNA的方法,1、提取生物大分子的基本思路,选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子,2、提取DNA的基本思路,利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分,3、DNA的溶解性,DNA和蛋白质等其他成分,在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反,根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的,？,DNA在,NaCl溶液中的溶解度曲线图,在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。,如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？,当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时，DNA的溶解度最大，浓度为 014 molL时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。,DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离,5、DNA在酒精溶液中的溶解性,6、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响,大多数蛋白质不能忍受6080的高温，而DNA在80以上才会变性,洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响,7、DNA的鉴定,DNA与,二苯胺（沸水浴）,会染成,蓝色,，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂,二、实验设计,（一）实验材料的选取,1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取23种实验材料）,2、原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大,动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、动物细胞,答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA,讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜,2、植物细胞,讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？,答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解,实例：提取洋葱,DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液,答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等,讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,（三）去除滤液中的杂质,为了纯化提取的,DNA需要将滤液作进一步处理,讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？,答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离,（四）,DNA的析出与鉴定,DNA的析出用的是与滤液体积相等的,冷却的酒精溶液（体积分数为95）,，静置23min，溶液中会出现,白色丝状物，,这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿,一个方向,搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水,1、DNA的析出,2、DNA的鉴定,鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入,二苯胺,4ml 试剂。混合均匀后，将试管置于,沸水中加热,5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有,蓝色,鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图,2mol/L,鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图,5、过滤取纱布上的滤物,纱布过滤,6、再次溶解DNA,2mol/LNaCl溶液,取滤物,鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图,7、加冷酒精使DNA析出（纯化）,冷酒精,鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图,DNA的鉴定,DNA的粗提取与鉴定,实验原理,DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,DNA与其他细胞成分在酒精中溶解度不同,DNA和蛋白质对酶、高温和洗涤剂耐受性不同,DNA与二苯胺呈现蓝色反应,DNA粗提取,选择适宜材料,破碎细胞,DNA的溶解和析出,DNA的纯化,鉴定DNA,与二苯胺混合，沸水浴，呈现蓝色反应,总结：,方法步骤,加入物质,目的,1,.,制备鸡血细胞液,柠檬酸钠溶液,2,.,提取鸡血细胞细胞核物质,20 m1,蒸馏水,3,.,溶解细胞核内的,DNA,2 mo1,L,的,NaCl,溶液,40,mL,4,.,析出含,DNA,的黏稠物,蒸馏水,5,.,滤取含,DNA,的黏稠物,6,.,将,DNA,的黏稠物再溶解,2 mol,L,的,NaCl,溶液,20 mL,7,.,过滤含,DNA,的,NaC,l,溶液,8,.,提取含有杂质较少的,DNA,冷却的,95,的酒精,50 mL,A,:,(1),向试管中加入,2mol,L,的,NaCl,溶液,5,mL,(2),加入,DNA,(3)4 mL,二苯胺试剂,9,.,DNA,的鉴定,B,:,(1),向试管中加入,2mol,L,的,NaCl,溶液,5,mL,(2)4 m,L,二苯胺试剂,加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固,加速血细胞破裂,溶解,DNA,使,2mol/L的NaCl溶液稀释至0.14mol/L使得DNA最大限度地释出,使含,DNA的黏稠物被留在纱布上,使含,DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中,除去含,DNA的滤液中的杂质,提取,DNA,A出现蓝色 B无变化,DNA,的粗提取与鉴定,一、实验原理,1.,血细胞在蒸馏水中会渗透吸水过度而导致细胞膜和细胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有DNA的溶液。,2.,DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度的变化而改变的。DNA在,物质的量浓度为0.14 molL的氯化钠溶液中的溶解度最低，,利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的,DNA析出,。,3.,DNA不溶于酒精溶液,，,但细胞中的,某些物质则可以溶于酒精。,利用这一原理，可以进一步,提取出含杂质较少的DNA,。,4.,DNA遇二苯胺（沸水浴）会变成蓝色，因此，,二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂,。,二、方法与过程,1.制鸡血细胞液,（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）,0.1,g/mL柠檬酸钠100,mL,活鸡鲜血,180mL,500mL烧杯中，玻棒,搅拌,，离心、分离或静置沉淀。,2.提取DNA,取血细胞5-10mL20mL蒸馏水，用玻棒沿一个方向,快速搅拌,。,纱布,过滤,：滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质。,原理：血细胞的细胞膜、核摸吸水胀破，玻璃棒,快速搅拌,，机械加速血细胞破裂。,.提取,血,细胞核物质：,.溶解核内的DNA：,滤液2mol/L的NaCl溶液40mL，玻棒沿一个方向,轻缓搅拌,。,.,析出,含DNA的粘稠物：,.滤取含DNA的粘稠物：,.DNA粘稠物的再溶解：,在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向,轻轻搅拌,，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加水（此时NaCl溶液的浓度相当于0.14mol/L）。,用多层纱布,过滤,，含DNA的粘稠物留在纱布上。,20mL 2mol/L的NaCl溶液,步骤含DNA的粘稠物,在,20mL烧杯中,轻缓搅拌,3,min，使尽可能多的DNA溶解在,NaCl溶液,。,.过滤含有DNA的NaCl溶液：,用放有两层纱布的漏斗,过滤,步骤所得的溶液，滤液中含有DNA。,.提取含有杂质较少的DNA：,步骤所得的滤液体积分数为95%的冷却酒精50mL，用玻棒沿一个方向,轻缓搅拌,，溶液中（,析出,）出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。,3.DNA的鉴定：,加入二苯胺试剂4mL，用玻棒,搅拌,使DNA溶解，沸水浴5min，观察溶液是否出现蓝色。,1.共有“,三次过滤，两次析出，七次搅拌,”,2.加入“,两次蒸馏水，,三次NaCl,溶液,，一次酒精,”,三、实验小结,练习,1、请解释提取DNA的实验操作中主要的步骤的目的。,答：提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。,2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取DNA一样容易吗？,答：提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。,2.实验中NaCl的物质的量浓度为2 molL和0.14 molL对DNA有何影响?,1.在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是()。,A.稀释血液、冲洗样品,B.使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出,C.使血细胞破裂、增大DNA溶解量,D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA,B,答：,前者是溶解DNA，后者是使DNA析出,3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成(),A.砖红色 B.橘黄色 C.紫色 D.蓝色,4.提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液,中的上清液?,答：,DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以要除去上清液(含有蛋白质)。,D,