第3章 细胞融合与单克隆抗体-1

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第三章 细胞融合与单克隆抗体,3.1,细胞融合,(cell fusion),定义,:,在离体条件下用人工的方法,把不,同种的细胞通过,无,性,方式,融合成,一个杂合细胞的技术。,3.1.1,细胞融合的发展历史,“,自发,”,细胞融合现象：,1838,年,Muller,多核的肿瘤细胞,1858,年,Virchow,正常组织、发炎组织及肿,瘤组织,多核细胞,1873,年,Luginbuhl,天花病人,多核体血细胞,1875,年,Lange,蛙类血液细胞发生合并,3.1,细胞融合,(cell fusion),3.1,细胞融合,(cell fusion),3.1,细胞融合,(cell fusion),重要事件,1962,年,(,日,),冈田善雄 仙台病毒促细胞融合,70,年代,(,华裔加籍,),高国楠,PEG,促植物原生,质体的融合,80,年代，电融合,3.1,细胞融合,(cell fusion),植物细胞融合：,1972,年（美）,P.S.Carlson,杂种烟草,现代植物细胞融合的开始,1978,年（德）梅歇尔斯,“,pomoto,”,3.1,细胞融合,(cell fusion),“,Pomoto,”,3.1,细胞融合,(cell fusion),3.1.2,植物原生质体培养与细胞融合,(Protoplast and Cell fusion),植物原生质体培养,植物细胞融合,3.1,细胞融合,(cell fusion),3.1.3,动物细胞融合,动物细胞融合是研究细胞遗传信息转移，基因在染色体上的定位以及创造新细胞株的有效途径。,3.1,细胞融合,(cell fusion),肿瘤细胞与树突状细胞的融合,3.1,细胞融合,(cell fusion),人纤维肉瘤细胞与小鼠畸胎瘤细胞融合,1978,年,(,瑞士,),埃勒门斯,(,美国,),柯路斯,3.1,细胞融合,(cell fusion),3.1,细胞融合,(cell fusion),3.1.4,细胞融合的诱导,诱导融合的方法,:,物理法,:,电场刺激,激光,显微操作,化学法,:,聚乙二醇,(PEG),结合高,pH,、,高钙离子法,生物法,:,仙台病毒,3.1,细胞融合,(cell fusion),不同细胞融合的条件及其主要应用,来 源,前处理,融合方法,主要应用,动物细胞,不需,仙台病毒、,PEG,、电融合,生产单克隆抗体,植物细胞,脱壁,PEG,、电融合,创造植物新品种,微生物细胞,脱壁,PEG,高产优质新菌种,3.1,细胞融合,(cell fusion),仙台病毒诱导,仙台病毒,(Sendal virus),也称日本血凝病毒,HVJ,，属粘病毒副流感类群，是,RNA,病毒，多型颗粒状，易在小鼠中蔓延。,3.1,细胞融合,(cell fusion),融合的可能机制：,病毒被膜含有糖蛋白，其表面还分布有许多具有神经氨酸酶和凝血活性的突起，神经氨酸酶可降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集，再通过膜上蛋白质分子的重新分布，使膜中的脂类分子重排，而打开质膜，导致细胞融合。,3.1,细胞融合,(cell fusion),融合过程：,1.,病毒颗粒附着细胞膜上起搭桥作用，使细胞,粘着成堆，在,4,冰浴中细胞紧密靠近，但不,发生融合。,2.37,温浴后，粘结部位的细胞膜破坏，形成,通道，细胞质流通、融汇。,3.,病毒颗粒进入细胞质，此时两个细胞合并、,变圆，完成融合，全过程约,15,30,分钟。,4.,细胞核也相互合并,完成细胞融合,3.1,细胞融合,(cell fusion),3.1,细胞融合,(cell fusion),PEG,诱导,PEG,聚乙二醇,(polyethylene glycol),商品名：卡波蜡,(carbowax),多聚化合物，分子式,H(OCH2,CH2)nOH,实验室用,PEG,平均分子量在,200,20,000,一般：,1,000,固体,常用分子量：,4000,6000,3.1,细胞融合,(cell fusion),融合的可能机制,？,脱水作用能使细胞凝聚，并使膜结构发生,变化,？,改变膜表面电荷或膜电位，而导致膜上蛋,白质颗粒聚集及膜脂分子随之发生重排之,故。,？,3.1,细胞融合,(cell fusion),初步分析,可能是由于带有大量负电荷的,PEG,分子和原生质体表面的负电荷间，在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高,pH,、高钙离子溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的,PEG,分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。,3.1,细胞融合,(cell fusion),PEG,诱导过程注意事项：,控制,与分子量、浓度和处理时间,悬浮法：将细胞悬于,40,50,的,PEG4000,进行,溶，处理,1,2,分钟为宜。,离心法,：,先将细胞混合物悬于,30,40,的,PEG4000,，再离心进行融合，则可适,当延长融合时间，以,5,8,分钟为宜。,3.1,细胞融合,(cell fusion),PEG,诱导注意事项：,pH,值以,pH7.4,8.0,为宜，或略偏,碱性,pH8.0,8.2,。,辅以,5,15,的,DMSO,或在融合前用,PHA,处理一下，效,果更好。,3.1,细胞融合,(cell fusion),PEG,融合法优点,效率高,材料方便，操作简易,效果稳定,PEG,融合法缺点,对细胞有毒性,3.1,细胞融合,(cell fusion),3.1,细胞融合,(cell fusion),物理电融合诱导,机制,在直流电脉冲的诱导下,原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位变化,使原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭合成完整的细胞融合体,3.1,细胞融合,(cell fusion),电融合诱导法原理示意图,3.1,细胞融合,(cell fusion),电融合优点：,融合效率高，可达,50,80,产生杂交细胞的频率高，是,PEG,法的,100,倍。,操作简便、稳定，但需设备。,对细胞无毒害作用。,可在显微镜下观察操作。,3.1,细胞融合,(cell fusion),融合率,融合细胞的细胞核总数,视野内全部细胞的细胞核总数,100,融合率,=,3.1,细胞融合,(cell fusion),植物细胞融合基本过程,去除细胞壁以获得大量的原生质体,诱导细胞融合形成杂种细胞,细胞相互靠近,形成细胞桥,最关键的一步,胞质渗透,细胞核融合,筛选,培养,促进细胞分裂,分化,从细胞团,愈伤组织到最后成株,3.1,细胞融合,(cell fusion),动物细胞融合基本过程,动物单个细胞的获得,组织的获得,组织的消化,诱导细胞融合形成杂种细胞,筛选，培养,3.1,细胞融合,(cell fusion),3.1,细胞融合,(cell fusion),植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较,比较项目,植物体细胞杂交,动物细胞融合,细胞融合的原理,细胞膜的流动性、植物细胞全能性,细胞膜的流动性,细胞融合的方法,去处细胞壁后诱导原生质体融合,使细胞分散后诱导细胞融合,诱导方法,物理（显微操作、电融合）,化学（聚乙二醇）,物理、化学方法（同左）,灭活的病毒,用途,获得杂种植株,制备单克隆抗体,3.1,细胞融合,(cell fusion),影响细胞融合的因素,(1),亲本细胞表面性质，表面覆盖绒毛而不规则者较易融,合；表面光滑者较难融合。,(2),细胞种类不同，融合效果不同，如腹水癌及株化细胞较易,融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。,(3),细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙台病毒诱导欧,利希氏腹水癌细胞融合时，于,37,振摇时易于融合，且,融合效率与病毒量呈正比。但在,34,振摇则融合率下降。,在,37,时不振摇则几乎不融合。,影响细胞融合的因素,3.1,细胞融合,(cell fusion),(4),细胞融合过程中，通常耗氧量较大缺氧时,经常不,融合。空气中含氧量大于,20,时有一定融合率，但有些细胞在无氧条件下也可融合。,(5),有些细胞融合时需要,Ca2+,，否则不融合，细胞蛋白质亦发生,变化。实验表明,Sr2+,、,Ba2+,、,Mg2+,、,Mn2+,等离子可代替,Ca2+,但有效浓度较,Ca2+,大的多。融合时最适合的离子强度,一般为,0.1mol/L,(6),最适合的,pH,为,7,4,7,8,之间，在此范围之外，融合率均较,低。,3.1,细胞融合,(cell fusion),融合细胞的特征及其意义,染色体组不稳定，尤其种间杂交细胞,培养过程中染色体会逐渐丢失,3.1,细胞融合,(cell fusion),理论研究,基因定位和绘制基因图工作,中十分,有用,应用价值,单克隆抗体,植物,育种,3.1,细胞融合,(cell fusion),融合细胞类型,同核体（,homokaryon,）,异核体,(heterokaryon,）,多核体（,polykaryon,）,异胞质体,(heterocybrid),3.1,细胞融合,(cell fusion),同核体,(homokaryon),同源细胞的融合体。由于是同源细胞，它们的基因型及表现型完全一样。,3.1,细胞融合,(cell fusion),异核体,(heterokaryon),非,同源细胞的融合体。一般是亲源关系较近的细胞，这种亲和杂种细胞含有双亲全部细胞核和细胞质物质，其发育的个体也是可育的，如烟草属种间的细胞杂种。,3.1,细胞融合,(cell fusion),多核体,(polykaryon),含有,双亲不同比例核物质的融合体。亲源关系较远的细胞间融合，融合体以一个细胞的核物质为主，只加入另一细胞少量遗传物质，如胡萝卜与羊角芹形成部分亲和的杂种细胞。,3.1,细胞融合,(cell fusion),异胞质体,(heterocybrid),不同,胞质来源。用射线或细胞松弛素,B,处理一亲本细胞，使其选择性地丢失核基因形成一个无核的亚原生质体，再与一个有核的原生质体融合，获得一个完整的原生质体与另一亲本的细胞质融和的异胞质体。,3.1,细胞融合,(cell fusion),杂种细胞筛选方法,（,1,）遗传互补筛选法,（,2,）抗性互补筛选法,（,3,）生长特性筛选法,（,4,）物理特性筛选法,3.1,细胞融合,(cell fusion),