CR技术的原理、操作及应用

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,PCR,技术的原理、操作及应用,湖南省疾病预防控制中心微生物检验科,黄一伟,什么是PCR,PCR:Polymerase chain reaction,，即聚合酶链反应,是,80,年代中期发展起来的体外核酸扩增技术,PCR技术的发展历史,关于,PCR,的文章首次由美国科学家,Kary,Mullis,等人在,Science,杂志上发表,Science,杂志报道了耐热性,DNA,多聚酶,Taq,酶（生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的,DNA,聚合酶）的发现,预示着分子时代的到来。,12,月,Science,杂志将,PCR,和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。,1993,Kary,Mullis,因,PCR,的发明获得诺贝尔化学奖。,PCR技术的原理 1,遗传物质：,细胞核,染色体,DNA,（脱氧核糖核酸和磷酸链和碱基构成,),碱基（,A,、,T,、,C,、,G,）是按双链螺旋排列的，碱基序列的长度和排列的顺序决定了生物的多样性。,比如人类体细胞中共有,31,亿个碱基对，按上述的,0.1%,的差，人和人之间有,3,百万个碱基对的差别。,PCR,的基本工作原理就是以拟扩增的,DNA,分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在,DNA,聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的,DNA,合成。,PCR技术的原理 2,PCR,反应的基本成分,包括,7,种基本成分：模板,DNA,、特异性引物、热稳定,DNA,聚合酶、脱氧核苷三磷酸（,dNTP,）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子,基本反应步骤：变性,-,退火,-,延伸,最后通过染料如,EB,染色,DNA,后在紫外灯下显色检出,PCR技术的原理 3,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,13,步,2535,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,RT-PCR的原理,相对于,PCR,，在开始阶段增加步骤：,RNA,cDNA,合成，是单链到双链的过程。,实时荧光定量PCR的原理 1,实时荧光定量PCR技术,(Real-Time Quantitative PCR),是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累,实时监测,整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,常用的荧光定量,PCR,试剂：,SYBR Green I,Taqman,水解探针,实时荧光定量PCR的原理 2,基线（,Baseline,）,是指在,PCR,扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。,光阈值,threshold,的设定,一般将,PCR,反应前,15,个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是,PCR3-15,个循环荧光信号标准差的,10,倍，荧光域值设定在,PCR,扩增的指数期。,CT(Cycle threshold),值,表示每个,PCR,反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的,CT,值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，,CT,值越小，反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表,CT,值。因此，只要获得未知样品的,CT,值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,实时荧光定量PCR的原理 3,Ct,与初始模板的关系,固定循环数后，荧光信号与模板数成正比,初始,DNA,量越多,荧光达到阈值时所需要的循环数,(Ct,值,),越少,起始模板的对数浓度与,Ct,呈线性关系，根据样品的,Ct,值就可计算出样品中所含的模板量,阈值,10,4,10,3,10,2,PCR技术的优点,优点,:,特异,敏感,快速、简便,易自动化等,PCR技术的局限性,为了构建特定引物，使特定DNA序列的选择性扩增，必须有一个庞大的已知序列的数据库。,聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的因素需要优化反应条件。,PCR技术扩增产物的长度有限。,PCR技术的注意事项,防止污染，建立良好的质量控制。操作时避免气溶胶产生，特别注意阳性样品的拿放，使用一次性耗材，穿戴手套并经常更换，永远在最后一步才加核酸，液体分装使用等。,引物设计合理,Taq,酶扩增错误率较高，大约,1/100,对碱基,/20,个循环,镁离子浓度对反应效率的影响,仪器稳定性，升降温速率，管子的密合度等,RT-PCR,注意防止,RNA,降解,PCR技术的操作 1,以流感病毒的,RT-PCR,和,Real-time RT-PCR,检测为例说明,PCR,技术的操作步骤,主要仪器：,PCR,仪，,Real-time PCR,仪，微量移液器，高速冷冻离心机，电泳仪和电泳槽，凝胶电泳观察仪或成像系统，生物安全柜等。,PCR技术的操作 2,1.,病毒核酸,RNA,提取,2.RT-PCR,反应或者,Real-time RT-PCR,反应,3.UV,紫外灯检测或者电脑上直接读取结果,流感病毒核酸提取 1,试验材料,QIAGEN,公司的,Rneasy Mini Kit,(,或,QIAGEN,公司的,QIAmp Viral RNA Mini Kit,，操作类似,),-,巯基乙醇（,-mercaptoethanol,）,70%,乙醇,无菌及,DNA,RNA,酶的,1.5ml,离心管,10l,、,20l,、,200l,、,1000l,加样器和枪头,可调,13K,微型冷冻离心机,待检流感病毒,200l,流感病毒核酸提取 2,1,、取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）,200ul,加在,1.5ml Eppendorf,管中,2,、依次加入,350ul RLT,液、,3.5ul-,巯基乙醇和,70%,的乙醇,550ul,混匀,3,、将,Rneasy mini spin,柱子置于干净的,2ml,收集管上，将,2,步骤的混合液,600ul,吸出加入柱子中，,12,，,000rpm,，离心,15,秒，弃收集管中的离心液,4,、柱子仍放回收集管上，将,2,步骤剩余的混合液全部吸到柱子上，,12,，,000rpm,，离心,15,秒，弃离心液,5,、于柱子中加入,700ul Wash Buffer RW1,液，,12,，,000rpm,，离心,15,秒,6,、取一支干净的,2ml,收集管，将离心后的柱子移到新的收集管上，于柱子中加入,500ul Wash Buffer RPE,液，,12,，,000rpm,，离心,15,秒,7,、弃收集管中的离心液，再于柱子中加入,500ul Wash Buffer RPE,液，,13,，,000-14,，,000rpm,，离心,2,分钟,8,、将柱子移到一干净的,1.5ml,的,eppendrof,管上，于柱子中加入,20-50ul,的,Rnase-free Water,，室温静置,1-3,分钟,9,、,12,，,000rpm,，离心,1,分钟，收集离心液即为提取的病毒,RNA,，立即做实验或,-20,以下保存,试剂盒为,QIAGEN,公司的,RNeasy Mini Kit,（,catalog#74104,）,注意：试剂盒中的,RPE,液用前需加,44ml,的无水乙醇，使终体积达到,55ml,。,RT-PCR反应 1,试验材料,QIAGEN One Step RT-PCR Kit,（,Cat No 210212,）,RNase,inhibitor 40u/l,上游引物,200ng/l,下游引物,200ng/l,扩增,H5,亚型禽流感病毒的引物 序列为：,H5-1:5-GCC ATT CCA CAA CAT ACA CCC-3,，,H5-3:5-CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG-3,提取的,RNA,RT-PCR反应 2,1,、分别标记好,0.2ml,的微量离心管。,在每个管中加入如下内容：,5 ul QIAGEN OneStep RT-PCR buffer,，,5,1 ul 10mM dNTPs,1 ul Enzyme Mix,0.13ul RNase inhibitor(40U/ul),14.3ul Rnase-free water,2,、加,1ul,的引物,加,5ul,未知,RNA,或,5 ul,阳性对照或,Rnase-free water,作为阴性对照。,RT-PCR反应 3,OneStep RT-PCR,反应条件如下：,50,作用,30,分钟（逆转录：,RNA,cDNA,）,95,作用,15,分钟（使逆转录酶等失活）,94,变性,30,秒,55,退火,30,秒,72,延伸,30,秒,回到第,3,步，,34,个循环,72,作用,2,分钟,结束,RT-PCR扩增产物检测 1,凝胶电泳缓冲液配方,10TBE,缓冲液,(,每升,),：,Tris107.8g Boric Acid55.0g EDTA(Na2)8.2g,10TAE,缓冲液,(,每升,),：,Tris48.4g,冰乙酸,11.42g 0.5mol/L EDTA 20ml,用电泳缓冲液制备,1.5%,琼脂糖凝胶，按每孔,8ulPCR,产物上样至胶中。,100,伏电泳,30min,，紫外观察并拍照记录。,RT-PCR扩增产物检测 2,RT-PCR扩增产物检测及结果判定,Real-time RT-PCR的操作 1,病毒核酸,RNA,提取：同,RT-PCR,Real-time RT-PCR,：以匹基公司禽流感检测试剂盒为例，按试剂盒操作说明，,25l,反应体系：,RT-PCR,反应液,15l,，,Taq,酶,0.25l,，逆转录酶,n/4,颗（,n,为,PCR,管数），待检,RNA 10l,，加好,RNA,后,400g,离心,5sec,，将,PCR,管排好放入荧光,PCR,检测仪内，记录样本摆放顺序。反应条件为：,42 30min,；,92 3min,；,92 10sec,45 30sec 72 1min 5,个循环；,92 10sec,60 30sec 40,个循环，,60,时设置收集荧光。,Real-time RT-PCR的操作 2,结果分析条件设定,读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准；或可根据仪器噪音情况进行调整。,CT(Cycle threshold),值,表示每个,PCR,反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的,CT,值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，,CT,值越小，反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表,CT,值。因此，只要获得未知样品的,CT,值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,基线（,Baseline,）,是指在,PCR,扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。,光阈值,threshold,的设定,一般将,PCR,反应前,15,个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是,PCR3-15,个循环荧光信号标准差的,10,倍，荧光域值设定在,PCR,扩增的指数期。,Real-time PCR的操作 3,结果判定,1,、质控标准,1.1,阴性对照的检测结果为阴性。,1.2,阳性对照的,Ct,值应小于等于,28.0,。否则，此次实验视为无效。,2,、结果判断,2.1 Ct,值无数值的样本为阴性样本。,2.2 Ct,值,30.0,的样本为阳性。,2.3Ct,值大于,30.0,的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。,PCR技术的应用,基因克隆、测序和表达等,法医学个体识别和亲子鉴定,遗传性疾病检测、肿瘤诊断、病原体检测等,基因克隆和表达,DNA指纹技术 1,1984,年英