生物分离纯化与技术(精品)

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,组员：严帆，周小东，罗双，南蒙，任秋阳,生物分离与纯化技术,课题：猪胰蛋白酶的分离纯化,猪胰蛋白酶的分离与纯化,主要内容：,一,、,胰蛋白酶的基本特性,二,、采用的分离纯化方法,的原理,1.,沉淀法,2.,透析法,3.离子交换层析技术,4.亲和层析法(进一步纯化）,三,胰蛋白酶的分离纯化,四蛋白质含量的测定,五酶活力的测定,一、胰蛋白酶的基本特性,胰蛋白酶是以,无活性的酶原,形式存在于动物胰脏中，在,Ca,2+,的存在下，被,肠激酶,或,有活性的胰蛋白酶,自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为,有活性的胰蛋白酶,。,猪胰蛋白酶的分子量约为,23.4 kDa,，其等电点约为,pI=10.8,，最适,pH7.68.0,，胰蛋白酶在,pH=3左右,较稳定，,Ca,2+,离子对胰蛋白酶有稳定作用，在低温条件下贮存数周内酶的活性不发生明显的改变。,二、分离纯化,应用的一些,方法,原理,盐析沉淀法：用硫酸铵盐析法将目的蛋白从粗提液中沉淀出来，使其得到浓缩，并除去部分杂质（核酸、杂蛋白等）。,1.沉淀法,二、分离纯化方法的原理,由于膜两侧的,溶质浓度不同,，在,浓度差,的作用下，高分子溶液（如蛋白溶液）中的小分子溶质（如无机盐）,透向,透析液一侧，同时透析液中的缓冲液,渗入,蛋白溶液一侧，经过透析液反复换液后，即可达到脱盐和置换缓冲液,的目的。,2,.透析法,二、分离纯化方法的原理,同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合。,蛋白质在其等电点以下（pHpI），带负电荷，可被阴离子交换树脂所吸附。,本实验中的猪胰蛋白酶等电点为,pI=10.8，在pH=5.0的缓冲液中,猪胰蛋白酶,带正电荷,，可被,阳离子交换树脂,所吸附（本实验采用,CM-纤维素离子交换树脂,）；而带负电荷的杂蛋白不被吸附而除去，带正电荷的杂蛋白也被吸附，但不同蛋白与树脂的吸附能力不同，通过增加缓冲液中的离子强度及提高pH，可将蛋白从树脂上洗脱下来。,在不同的离子强度下，可将不同的蛋白分别洗脱（结合力弱的蛋白最先洗脱，结合力强的蛋白最后洗脱）。,通过以上离子交换层析法，即可将目的蛋白和杂蛋白分开，从而得到纯化。,3.离子交换层析法,二、分离纯化方法的原理,4.亲和层析法:,亲和层析是由吸附层析发展起来的，主要是根据生物分子与特定的固相化配基（ligand）之间的亲和力而使生物分子得到分离的。所谓亲和力是指：范德华力、疏水力、静电力、氢键等，它存在于某些分子内部，也是维系着某些分子之间的结合力。酶与底物、酶与抑制剂、抗原与抗体、激素与激素受体等彼此分子之间的结合力就是亲和力。亲和力是很弱的，只有在彼此分子挨得很近的条件下才显示出来。所以要求两分子之间的结合具有高度特异的分子基础，即分子间的互补结构。利用这种具有亲和力的生物分子间可逆的结合和解离的原理发展起来的层析，就称为亲和层析。,一、,猪胰蛋白,酶的分离纯化,（1）,粗猪胰蛋白酶的提取,（2）,透析,（3）,离子交换法纯化猪胰蛋白酶,(4)亲和层析法纯化猪胰蛋白酶,1.粗猪胰蛋白酶的的提取,加5倍体积预冷的PH2.5乙酸酸化水,取猪胰脏，除去脂肪和结缔组织，切碎，称重约50,用组织捣碎机捣碎,用4层纱布过滤得上清液,将研细的固体无水氯化钙慢慢加入原酶溶液中，边搅拌均匀，使溶液最终含有0.1mol/L CaCl2,加入极少量猪胰蛋白酶（约2-5mg),轻轻搅拌均匀,用5mol/LNaOH调PH8.0,于25,活化4-6小时（2小时取样一次），测定酶活性增加的情况活化完成后，用2.5mol/L硫酸，调节PH至2.5-3.0,量取体积，加入固体硫酸铵达到75%饱和度，静置过夜,沉淀为粗胰蛋白酶,离心10000rpm,15min,(收集约1.5ml,作为留样1，测蛋白含量，及时SDS化,),离心10000rmp,15min,收集约为1.5ml,作为样液2，测量蛋白含量，及时SDS化,一、,猪胰蛋白酶的分离纯化,将粗胰蛋白酶溶于适量预冷的0.001 mol/L HCl溶液中（,用2 mol/L HCl调蒸馏水pH至3即可！,）。,在4下对0.001 mol/L HCl溶液透析3小时左右（,每小时换液1次,！,）,而后改用0.01 mol/L,pH5.0柠檬酸钠缓冲液透析（,至少换液3次，第一次1小时后换液，第二次是2小时后换液，第三次是3小时后换液，然后过夜透析！,）,（记录样品体积，收集约1.5 mL，作为留样3，测蛋白含量，及时SDS化）,（2）透析,恒流泵,部分收集器,离子交换柱,离子交换流程简图,一、猪胰蛋白酶的分离纯化,（3）离子交换层析法纯化猪胰蛋白酶,离子交换层析法初步纯化猪胰蛋白酶,柱的平衡：用0.01mol/L,PH5.0柠檬酸钠缓冲液平衡CM-纤维素离子交换柱,样品吸附：直接上样于CM-纤维素离子交换柱,洗涤：用0.01mol/L，PH5.0柠檬酸钠缓冲液充分洗净未吸附蛋白,洗脱1：用0.01mol/L,PH5.0柠檬酸钠缓冲液洗脱并,分部收集样品,，,测定每个样品的蛋白含量,，,做层析曲线，将出现一个蛋白峰（,收集样品为留样4,），此峰为,猪胰凝乳蛋白酶,。,洗脱2：待猪胰凝乳蛋白酶后改用用0.1mol/L,PH6.0柠檬酸钠缓冲液洗脱，此时出现一洗脱峰，并收集洗脱,测定每个样品的蛋白含量,，,做层析曲线，将出现一个蛋白峰（,收集样品为留样5,），此峰为,猪胰蛋白酶,。,再生柱子（0.5mol/LNaOH),用蒸馏水洗至中性,恒流泵,上样,用0.01 mol/L,pH5.0柠檬酸钠缓冲液透析后的粗酶液,注：需将未吸附样品（流穿）进行SDS-PAGE检测！,装柱 平衡,沿壁倒下,均匀,无气泡、裂纹,装柱,平衡,离子交换树脂,1 ml/min,0.01 mol/L,pH5.0柠檬酸钠缓冲液,3cm,0.01 mol/L,pH5.0柠檬酸钠缓冲液,恒流泵,洗涤,0.01 mol/L,pH5.0柠檬酸钠缓冲液,恒流泵,洗脱1,0.05 mol/L,pH5.0，柠檬酸钠缓冲液,离子交换柱,部分收集器,恒流泵,洗脱2,0.1 mol/L,pH6.0，柠檬酸钠缓冲液,离子交换柱,部分收集器,4,.,亲和层析分离胰蛋白酶,（进一步纯化）,(1)装柱,:取一支层析柱(101.0cm),将合成好的亲和层析介质CHOM-Sepharose 4B 装入柱内,自然沉降.,(2)平衡,:以0.1mol/L,pH8.0 Tris-HCl 缓冲液(内含0.5mol/L KCl,50mmol/L CaCl,2,)平衡.,(3)上样,:将以经激活的胰蛋白酶提取液,用5mol/L NaOH 精确调节pH值至pH8.0,滤纸过滤,取滤液上样.,(,4)平衡:,上完样以后,以0.1mol/L,pH8.0 Tris-HCl 缓冲液(内含0.5mol/L KCl,50mmol/L CaCl2)平衡,洗去未被吸附的杂蛋白。,(5)洗脱:,等平衡到基线稳定后,用0.1mol/L,pH2.5甲酸-0.5mol/L KCl溶液洗脱.收集洗脱峰。,二、蛋白质含量的测定,方法：,紫外吸收法,所测样品：,猪胰蛋白酶纯化过程中的预留,样品,1,样品,5,，用来计算,比活和纯化倍数,；,离子交换层析过程中的,分部收集样品,，用来作层析曲线（以样品管号为横坐标，以A280为纵坐标作曲线）,三、胰蛋白酶活性测定原理,胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，,对于由,碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所组成的肽键,具有专一性。特别表现在,对碱性氨基酸羧基一侧,的选择性。,胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成,不被三氯乙酸沉淀,的小分子肽以及氨基酸。在一定浓度范围内酶的水解滤液在波长280nm处光吸收的增值与胰蛋白酶的活力单位成正比,。,活力单位的定义：,在一定条件下每分钟酶水解底物,酪蛋白,形成的溶液在,280nm处吸光度A280增加一个,单位的酶量为一个蛋白酶活力单位（U）。,三、酶活力的测定,取3支试管按13编号：1为样品管、2 为对照管、3为空白管,1为样品管,稀释酶液,（根据蛋白含量测定结果，用0.1mol/L Tris-HCl、pH 8.0缓冲液稀释至1080g/mL ）,后，取,1 ml,；,精确加入,1mL,37 预热的10 mg/mL酪蛋白溶液；,混匀，立即置于37水浴中，准确反应10min；,加入,3 mL,8三氯乙酸，迅速摇匀，终止反应；,离心（3000 r/min,5min）取上清；,测A280,1.测定方法,2 为对照管,精确加入37,1ml,预热的10 mg/mL酪蛋白溶液；,加入,3 mL,8三氯乙酸，迅速摇匀；,加,1 mL,稀释酶液（与样品管相同）；,混匀，立即置于37水浴中，准确反应10min；,离心（3000 r/min,5min）取上清,测A280,3为空白管,分别加入,3 mL,8三氯乙酸和,2 mL,0.1,mol/L,Tris-HCl、pH 8.0 缓冲液，,离心（3000 r/min,5min）取上清,用该样品作为空白，用来测定样品管（1 ）和对照管（2 ）的A280。,三、酶活力的测定,胰蛋白酶活力单位数=A280/t,式中，A280样品管A280-对照管A280,t反应时间（min）,比活力=酶活力单位/毫克蛋白质=A280/CVt,式中，A280样品管A280-对照管A280,C每个样品管中酶液的浓度（mg/mL）,V每个样品管中酶液体积（mL),t反应时间（min）,2.胰蛋白酶活力的计算,三、酶活力的测定,猪胰蛋白酶纯化过程中的预留,样品,1,样品,5,，用来计算比活和纯化倍数；,离子交换层析过程中的,分部收集样品中，蛋白峰附近的样品。,3.需测样品,四、纯化效果检测,用12 的SDSPAGE,电泳,检测，考马斯亮蓝R-250染色。,粗酶液留样1，,胰酶激活后样品留样2，,透析后的样品3（上柱前样品）,未吸附样品（流穿）,离子交换层析后洗脱1（留样4）,离子交换层析后洗脱2中活力较高样品（留样5）,实验结果,1离子交换层析后收集各管样品的蛋白含量及活性。,2.以管数为横坐标、以A280及活性为纵坐标，制作双坐标图的,离子交换层析曲线,。,3测定粗酶液、胰酶激活后样品、离子交换层析收集管中样品液的体积及酶活力，完成,纯化表格,。,纯化表格,纯化步骤,总蛋白量（mg）,总酶活,（U）,比活（U/mg）,收率（）,纯化倍数,胰酶激活后样品,透析后上柱前样品,离子交换层析后的洗脱2,the end!,thank you,