分子生物学大实验-生科专业15学时

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,07,级生物科学专业,2009.8,分子生物学大实验,课程特点,时间长，集中，强度较大；,操作要求高，涉及的基本操作技能技巧较多；,实验中将接触一些有毒试剂（如,E.B.,和氯仿）。,课程要求,掌握实验原理，,实践、熟悉并规范分子生物学主要的技术操作，,学习药品及培养基配制方法。,实验前充分做好预习和各种准备，,熟悉实验指导中的实验操作过程，,准备一个实验记录本；,穿实验服，实验操作认真仔细，,小心有毒药品的使用；,组内做好安排和协调，,相互协作，互相谦让；,遵守时间，遵守纪律，不在实验室内大声喧哗，不做与实验无关的事情。,分子生物学主要技术,DNA,、,RNA,的提取,质粒,DNA,的提取,感受态细胞的制备及质粒,DNA,重组、转化和筛选,DNA,酶切,PCR,核酸及蛋白质杂交,1,、质粒,DNA,的提取及其酶切检测,质粒,DNA,提取技术（碱裂解法）,限制性内切酶酶切技术,电泳技术（琼脂糖凝胶电泳）,2,、聚合酶链式反应（,PCR,）,反应体系的构建,反应程序的设计,扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测,实验内容,质粒,DNA,的提取及其酶切检测,质粒,(plasmid),是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链,DNA,分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞。质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状如抗药性等，通过质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，这是筛选重组转化子的基础。,质粒复制和转录或多或少,依赖于宿主,编码的酶和蛋白质。,质粒分为严紧型和松弛型，我们现在使用的许多质粒（如,PUC,系列）多属松弛型质粒，能复制到很高的拷贝数，只要将培养物放在合适的培养基中生长到对数晚期，就可以用于质粒提取。,掌握碱裂解法提取质粒,DNA,的原理；,掌握质粒,DNA,的中小量提取方法；,掌握限制性核酸内切酶酶切,DNA,的原理和方法；,掌握质粒,DNA,酶切分析的方法。,实验目的,实验原理,本实验利用碱裂解法中量提取质粒,DNA,。在,NaOH/SDS,等作用下，细菌细胞壁遭到破坏，使,DNA,从细菌中释放出来。在碱性条件下，线性的大分子量细菌染色体,DNA,变性，将,pH,值调至中性，并有高盐浓度存在的条件下，染色体,DNA,之间交联形成不溶性网状结构，大部分,DNA,和蛋白质在去污剂,SDS,的作用下形成沉淀，而质粒,DNA,由于处于拓扑缠绕状态，能够迅速重新形成可溶性分子。通过离心，可去除大部分细胞碎片、染色体,DNA,、,RNA,及蛋白质，而质粒,DNA,仍留在上清中，用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。,限制性核酸内切酶是基因工程中最常用的工具酶。其作用特点是特异识别,DNA,分子中的碱基序列（一般为,4-6,个碱基对的反向重复序列），酶切后产生平齐末端或粘性末端。,本实验采用,EcoRI,酶切提取的质粒,pUC19,。,克隆载体,pUC19,质粒图谱,试剂,LB,液体培养基,STE,溶液：,0.1mol/LNaCl,，,10mmol/LTris.Cl,，,1mmol/LEDTA pH8.0,溶液,I,：,50mmol/L,葡萄糖，,25mmol/LTris.Cl,，,10mmol/LEDTA pH8.0,溶液,II,：,0.2mol/LNaOH,，,1%SDS,，现用现配（,0.4mol/LNaOH,和,2%SDS,等量混合）。,溶液,III,：,5mol/L,乙酸钾,60ml,，冰乙酸,11.5ml,，水,28.5ml,氯仿：异戊醇,=24,：,1,无水乙醇,70%,乙醇,10,限制酶缓冲液,限制酶,EcoR,I,pUC19,实验方法,仪器设备,恒温摇床、水浴锅、台式高速离心机、微量加样器、超净工作台,琼脂糖凝胶电泳试剂和仪器见其实验,1,、从选择性培养基平板上挑取单菌落，移至含有相应抗生素的,10mlLB,液体培养基中，于,37,振荡培养过夜。,2,、将培养物转移到一个,15mL,的试管中，,4000rpm,离心,10min,。,3,、弃上清，将细菌沉淀重悬于,1mlSTE,溶液中，剧烈振荡，充分悬浮，将悬浮液转移到,1.5ml,离心管中，,8000rpm,离心,5min,。,4,、弃上清，将细菌沉淀重悬于,200ul,预冷的溶液,I,中，剧烈振荡，充分悬浮。,5,、加,400ul,新配制,的溶液,II,到悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管数次，混合内容物，将离心管置于冰上。,6,、加,300ul,预冷的碱裂解液,III,，盖紧管口，反复颠倒数次，使之在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，然后将离心管置于冰上,3-5min,。,实验步骤,7,、,8000-10000rpm,，,4,离心,5min,，转移上清（约,600ul,）到一新的离心管中。,8,、加等体积的氯仿（酚：氯仿），通过剧烈振荡混合有机相和水相，,8000-10000rpm,，,4,离心,2min,，转移上清到另一离心管中。,9,、室温下加入,600ul,异丙醇以从上清中沉淀核酸，剧烈振动混合液，于室温下放置,2min,。,10,、,8000-10000rpm,，离心,5min,，收集核酸沉淀。,11,、小心弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，将液体吸干，加,1ml70%,乙醇洗涤沉淀。,12,、,8000-10000rpm,，离心,2min,；小心弃上清，将离心管置于超净台上吹干。,13,、用,100ul,含有（,20ug/ml,）,RNaseA,的,TE,溶液重新溶解核酸，温和振荡，,37,保温,40min,。（,略,）,14,、取,20ul,电泳观察并照相。（,略,）,15,、加灭菌双蒸水，将体积补至,1ml,，重复步骤,7-12,。（,略,）,16,、将沉淀溶于,60-100ul,灭菌双蒸水中，取,5ul,进行酶切分析（,2,份），取,20ul,电泳观察并照相。,17,、取,0.2ml,离心管，配制酶反应混合液，每,20ul,反应体系包含：,10,限制酶缓冲液,2ul,限制酶,EcoR,I 1ul,ddH,2,O 12ul,混匀。,18,、加入,5ul pUC19,，混匀（离心机）。,19,、,37,保温,30-45min,。,20,、加入上样缓冲液，,1%,琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果（以未酶切质粒做对照）。,聚合酶链式反应（,PCR,）,实验目的,掌握,PCR,原理,掌握,PCR,反应体系构建、反应程序设计及扩增产物检测的方法。,实验原理,在目的基因两端,人工合成两段已知序列的寡核苷酸引物,（通常两个引物序列不同），分别与模板,DNA,进行加热变性，随之将反应混合液冷却至某一温度，使引物与它的靶序列复性，复性引物在,DNA,聚合酶（,Taq DNA,聚合酶,）作用下，以,四种脱氧核苷酸为底物,，以,待测目的基因为模板,，得到延伸。,如此反复进行,高温变性、低温退火和中温延伸,（,denaturation-annealing-polymerization,）,三个步骤，模拟生物体内,DNA,复制扩增过程（一般,25-30cycles,）。每个循环扩增产物又可作为下一个循环的模板，因此理论上每完成一个循环，特定,DNA,片段的分子数目增加一倍，多轮扩增的结果使目的,DNA,片段以指数方式迅速积累，从而得到大量目的基因的新拷贝。,试剂,10,buffer,4dNTP,引物,1,、,2,、,3,Taq,酶,模板,DNA,-EcoT14I DNA,Marker,-Hind III Marker,实验方法,仪器设备,离心机、,PCR,仪、微量加样器,1,、配制,Mix,：每一,50ul,反应体积包括：,10,PCR buffer 5ul,4dNTP Mixture 4ul,引物,1,（,Control Primer 1,）,0.5ul,引物,2/3,（,Control Primer 2/3,）,0.5ul,Taq,酶,0.25ul,ddH,2,O 38.75ul,充分混匀。,2,、加入模板,(Control Template)DNA1ul,，轻缓混匀，轻微离心。,实验步骤,3,、放入,PCR,仪，按以下条件进行,PCR,反应。,使用引物,1,、,2,时（扩增,6,，,012bpDNA,片段）,循环：,94,45sec.,94,30sec.,55 30sec.30Cycles,72,4min.,72,1min.,4,使用引物,1,、,3,时（扩增,500bpDNA,片段）,循环：,94,30sec.,94,30sec.,55 30sec.28Cycles,72,30sec.,72,30sec.,4,预变性,后延伸,4,、,PCR,产物鉴定：加入上样缓冲液，混匀，离心，取,10ulPCR,产物电泳。,-EcoT14I Marker,和,-Hind III Marker,做对照。,预变性,后延伸,DNA,分子在碱性环境中（,pH8.3 buffer,）带负电荷，在外加电场作用下，向正极泳动。不同的,DNA,片段由于其分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率不同，从而可以区分不同的区带。电泳后经溴乙锭（,E.B.,）染色，在波长,254nm,紫外光照射下，,DNA,显橙红色荧光。溴乙锭检测,DNA,灵敏度很高，,10ng,或更少的,DNA,即可检出。,线性,DNA,在凝胶中迁移距离（迁移率）与它的分子量大小的对数成正比。将未知大小,DNA,的迁移距离与已知分子大小的,DNA,标准物（,DNA Marker,）的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未知,DNA,片段的大小。,实验原理,附：琼脂糖凝胶电泳实验,1,、用胶带或插板封住塑料托盘开放的两边形成一个模具，置于水平工作台上，将梳子插入模具，梳子距模具一端约,1cm,，梳齿底端距托盘表面保持,0.5-1mm,的间隙。,2,、称取,0.4g,琼脂糖置于三角瓶中,加入,40ml TAE buffer,以配制,1%,的凝胶，使用电炉子加热直至琼脂糖完全熔化，期间轻轻摇匀。,3,、待琼脂糖冷却至,65,左右,(,滴入,E.B.,至终浓度为,0.5,g/ml,，轻轻摇匀，,避免产生气泡,),，小心缓慢倒入模具内（避免产生气泡），使凝胶缓慢展开直至在托板表面形成一层约,3mm,厚的均匀胶层，室温下静置,0.5-1h,。,4,、待凝固完全后，双手均匀用力轻轻拔出梳子（注意切勿使样品槽破裂），在胶板上形成相互隔开的样品槽。,实验方法,5,、将凝胶连同托板放入电泳槽平台上，倒入适量,TAE buffer,直至浸没过胶面,2-3mm,，小心除去样品槽中的气泡。,6,、用微量加样器取样品（或,DNA Marker,）,20ul,，取,6loading buffer 5ul,，与样品（或,DNA Marker,）缓慢混合均匀（避免气泡），将混合样加入样品槽内（注意避免因样品过多而溢出，污染邻近样品）。,7,、加入样品后，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开始电泳，在样品进胶前可用略高电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压不高于,5V/cm,（电压值,V/,电泳槽两极之间距离,cm,）。,8,、当染料条带移动到距离凝胶前沿约,1cm,时，停止电泳。,9,、将电泳后的胶板小心推至含,0.5ug/mlE.B.,染色液中，室温下浸泡染色,30min,（略）。,10,、小心取出凝胶并用水轻轻冲洗表面的,E.B.,溶液（略），然后将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯台上的保鲜膜上，在波长,254nm,紫外灯下进行观察。,11,、,DNA,存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带，荧光会逐渐减弱，因此初步观察后，应立即拍照（或绘图），记录下电泳结果。,12,、参照,DNA Marker,估计未知大小,DNA,片段的分子量。,13,、在放大的电泳照片上用卡尺测量出,DNA Marker,各片段的迁移距离（,cm,），以各片段分子碱基对的对数为纵坐标，它们的迁移距离为横坐标，在坐标纸上连接各点划出曲线，制作出,DNA,分子的标准曲线。,14,、测量