甾体激素类药物的分析

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,甾体激素类药物的分析,甾体激素类药物的分析,第1页,概 述,激素,（,Hormone，,荷尔蒙）-是人体内各种,内分泌腺,所分泌一个生物活性物质。激素作用于特定称为靶器官组织、细胞上而发挥作用。假如激素分泌出现平衡失调，可使人体发生病变，如甲亢、糖尿病等。,甾体激素类药物的分析,第2页,甾体激素类药品均含有,环戊烷骈多氢菲,母核，基础骨架为：,第一节 基础结构和分类,甾体激素类药物的分析,第3页,一、肾上腺皮质激素,甾体激素类药物的分析,第4页,结构特点：,A,环3位为羰基、4，5位间为双键，形成共轭体系，标识为：,4,-3-,酮基,（又称,、,不饱和酮,结构），或写成:,4,-C,3,=O；,C,环11位上有羰基或羟基；,D,环17位上有,-,醇酮基,侧链（），而且多数还具,-,羟基,。,甾体激素类药物的分析,第5页,二、雄性激素及蛋白同化激素,（1）临床常见雄性激素为,睾丸素,（睾酮）衍生物，如丙酸睾丸素、苯乙酸睾丸素。,（2）常见蛋白固化激素有苯丙酸诺龙（苯丙酸去甲睾酮）、康力龙、康复龙等。,甾体激素类药物的分析,第6页,（1）结构特征（,两种激素之共同点,）：,A,环3位,4,-3-,酮基,（又称,、,不饱和酮,结构）；,D,环17位上无侧链，多为羟基。,（2）,两种激素,结构之不一样点：,蛋白同化激素10位上大多无角甲基，有4位有卤素。,甾体激素类药物的分析,第7页,（三）孕激素,又称黄体素或孕酮，临床上主要为黄体酮、己酸孕酮、安宫黄体酮和甲地孕酮等。,A,环,4,-3-,酮基,（,、,不饱和酮,结构）；,D,环17位上有,甲基酮,，有些含有羟基；,甾体激素类药物的分析,第8页,（四）雌激素,临床上常见,雌二醇,及其各种酯和炔雌醇及其衍生物，以及活性雌酮、雌三醇等。,A,环为苯环，3位上有酚羟基,，10位无角甲基；,D,环17位上有羟基或羰基，有还有乙炔基。,甾体激素类药物的分析,第9页,肾上腺皮质激素,雄性激素与,蛋白同化激素,雌激素,孕激素,C,3,C,3,O,4,-3=O,或,1，4,-3O,C,3,O,4,-3=O,C,3,OH,A,环为苯环,C,3,O,4,-3=O,C,10,C,13,有两个角甲基,有两个,有一个（C13）,C,13,有一个,有两个角甲基,C,17,醇酮基,OH,或其酯,OH,或有,C=CH,甲酮基,甾体激素类药物的分析,第10页,第二节 判别试验,（一）与强酸呈色反应（甾核）,许多甾体激素可与硫酸、磷酸、高氯酸、盐酸等呈色，主要与,硫酸,等呈色，机理可能是酮基质子化反应。,方法：取样品少许 观察颜色、荧光,再观察,H,2,SO,4,加水稀释后,一、化学判别法,甾体激素类药物的分析,第11页,（二）官能团反应,1,、,C,17,醇酮基反应,皮质激素,C,17,-,-,醇酮基含有还原性,，,能与许多氧化剂，如氨制,AgNO3、,斐林试剂、四氮唑盐反应。其中以,四氮唑盐,显色反应最为常见，不但可用作层析法显色剂，还可用于含量测定。,甾体激素类药物的分析,第12页,1、与碱性酒石酸铜试液反应,铜（）在碱性条件下可被还原物质还原为红色氧化亚铜沉淀。如：中国药典判别氢化可松,2,Cu +4OH,2+,-,+,Cu,2,O +H,2,O,橙红色,甾体激素类药物的分析,第13页,2、与氨制硝酸银试液反应,银（）在碱性条件下可被还原物质还原为黑色金属银沉淀。如：中国药典判别醋酸去氧皮质酮,2,Ag +2OH,+,-,NH,3,+2,Ag +CH,3,COOH,黑色,甾体激素类药物的分析,第14页,3、与碱性四氮唑盐显色反应,氯化三苯四氮唑（或蓝四氮唑）在碱性条件下可被还原物质还原为红色单甲鐕（或蓝色双甲鐕）。,H,2,O,+,OH,+,-,+,+,CH,3,COOH,红色,甾体激素类药物的分析,第15页,2,、酮基呈色反应,机理：分子中,C,3,=O,和,C,20,=O,能与普通羰基试剂如：2，4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼等显色。主要是,C,3,=O,与异烟肼,缩合,生成异烟腙而呈黄色。,甾体激素类药物的分析,第16页,盐酸酸性条件下：,4,-3O,：即刻反应,1，4,-3O,：13,min,C20,O,：长时间,甾体激素类药物的分析,第17页,3,、甲酮基或活性亚甲基反应,含,H,3,C-C=O（,甲酮基,）和,活性亚甲基,激素类药品与亚硝基铁氰化钠、芳香醛、间二硝基苯反应呈色。,（1）甲酮基呈色反应：,如黄体酮 蓝紫色，其它甾体呈淡橙色或不显色。（专属反应）,亚硝基铁氰化钠,甾体激素类药物的分析,第18页,（2）亚甲基反应：,如硫酸普拉睾酮,紫红色,乙醇,间二硝基苯,氢氧化钠,甾体激素类药物的分析,第19页,4,、酚羟基呈色反应,：,A,环为苯环雌激素+重氮苯磺酸盐 红色偶氮染料。,比如：,+,H,+,苯甲酸雌二醇,+,甾体激素类药物的分析,第20页,5、炔基沉淀反应,含炔基甾体激素，如炔雌醇、炔诺酮，遇硝酸银试液，即生成白色炔雌醇银盐沉淀及白色炔诺酮银沉淀。,6、卤素反应,（,有机氟呈色反应）,一些含有氟甾体激素药品（如醋酸氟轻松、醋酸地塞米松等），以氧瓶燃烧后生成无机氟化物，再与茜素氟蓝及硝酸亚铈起呈色反应。,甾体激素类药物的分析,第21页,7、酯反应,一些甾体激素类药品含有醋酸酯、戊酸酯及已酸酯结构，可先行水解，依据水解产物来判别。本类药品,C17,或,C21,位上羟基酯，可发生水解反应，生成对应酸与醇，如为醋酸酯，水解后生成醋酸可与乙醇反应，生成有香气醋酸乙酯。,戊酸或己酸酯类水解后可生成有特臭戊酸或己酸，进行判别。,甾体激素类药物的分析,第22页,（一）缩氨基脲生成,如苯丙酸诺龙（甾酮）+缩氨脲,苯丙酸诺龙缩氨脲,-,H,2,O,（二）酯水解,如丙酸睾丸素 睾丸素,醇制,KOH,H,2,O,水解,二、制备衍生物测定熔点,利用甾醇、甾酮类药品与一些试剂反应生成酯、肟、缩氨脲，或用醇制碱液水解甾体酯类生成对应母体，然后测定它们熔点进行判别。,甾体激素类药物的分析,第23页,三、紫外分光光度法,一些甾体激素药品分子中存在,和 共轭系统，在紫外光区有特征吸收。,甾体激素类药物的分析,第24页,四、红外吸收光谱,普通是将供试品所绘制,IR,光谱与药典附录中收载标准,IR,图谱进行对照比较（多采取,KBr,压片法），完全一致者即为同一药品。,五、薄层色谱,主要用于甾体激素判别、纯度检验及含量测定前分离和制剂稳定性研究，含有简便、快速、灵敏、分离度高等优点。,甾体激素类药物的分析,第25页,六、高效液相色谱法,在一定色谱条件下，比较甾体激素样品与其对照品峰保留时间进行判别。普通都要求在含量测定项下高效液相色谱图中，供试品峰保留时间进行应与对照品峰保留时间一致。,甾体激素类药物的分析,第26页,第三节 特殊杂质检验,甾体激素类药品多由其它甾体化合物或结构类似其它甾体激素经结构改造而来，所以可能带来原料、中间体、异构体、降解产物以及试剂和溶剂等杂质。有些杂质与该甾体激素药品结构类似，也含有一定药理作用而又互不相同，所以在甾体激素类药品质量控制中，,“,其它甾体,”,程度检验显得很主要。,甾体激素类药物的分析,第27页,一、其它甾体检验,我国药典和一些国家近版药典，,采取,TLC,法或,HPLC,法,检验甾体激素类药品中“其它甾体”。因为该法含有简便、快速、灵敏、分离效果好等优点，而广泛用于甾体激素药品判别、检验结构相同杂质等质量控制方法。,采取高低浓度对比法进行，即供试液与对照液均为同一物，但仅浓度有所不一样。详见,P251252。,结果判断：中国药典正文中对供试品要求了杂质斑点数目和每个杂质斑点不得超出限量。,甾体激素类药物的分析,第28页,二、硒检验,本类中一些药品在后工序用二氧化硒脱氢，,故应检验硒。,三、残留溶剂检验（甲醇和丙酮检验）,此为地塞米松磷酸钠残留溶剂检验，中国药典采取,GC,法检验。,四、游离磷酸盐检验,本法系利用在酸性溶液中磷酸盐中磷酸盐与钼酸铵作用生成磷钼酸铵，再经过还原形成磷钼酸蓝（钼蓝）在740,nm,处有最大吸收。,甾体激素类药物的分析,第29页,第四节 含量测定,常见方法有容量法、比色法、紫外分光光度法、荧光法、气相色谱法、高效液相色谱等。其中,紫外分光光度法,、,四氮唑盐比色法,、异烟肼法、铁-酚试剂比色法及,HPLC,法在药典中都有收载。,甾体激素类药物的分析,第30页,一、高效液相色谱法,各国药典采取反相高效液相法测定，方法普通为内标法。填充剂为十八烷基硅烷化键合硅胶；流动相多为甲醇-水、乙腈-水-异丙醇、甲醇-四氢呋喃-水等混合溶剂；检测器均为紫外光检测器，检测波长为240,nm,或254,nm。,为了提升分离效率、取得满意峰形，有时在流动相中加入醋酸缓冲液或磷酸缓冲液调整流动相,pH,值。,甾体激素类药物的分析,第31页,二、紫外分光光度法,本类药品分子结构中有共轭体系,4,-3-酮、,1，4,-3-酮、苯环、酚羟基等结构。,如皮质激素、雄性激素、孕激素及口服避孕药中有分子中,、,不饱和酮结构，在紫外光区,240,nm,附近,有最大吸收；含有苯酚结构雌激素在,280,nm,附近,有最大吸收，均可用紫外分光光度法测定含量。,甾体激素类药物的分析,第32页,1,、方法原理,甾体激素,C,3,上酮基,及一些其它位置上酮基都能在,酸性,条件下与,羰基试剂,如异烟肼、2，4-二硝基苯肼及氨基脲等起,缩合反应,，可作为含量测定依据。异烟肼是当前广泛采取一个，异烟肼（,INH）,试剂可与一些甾酮在酸性条件下形成,黄色,异烟腙，在一定波优点含有最大吸收。,（一）异烟肼比色法,三、比色法,甾体激素类药物的分析,第33页,一些含有,4,-3-酮和,C,20,酮基甾体激素可形成,双腙,，如黄体酮、可松、氢化可松等。,（,二）测定方法,分别制备供试品、对照品溶液，再分别与异烟肼溶液反应，在,420nm,波优点罚别测定吸收度并计算结果。,甾体激素类药物的分析,第34页,反应原理,皮质激素,C,17,-,-醇酮基,含有,还原性,，在强碱性溶液中能将四氮唑盐定量地还原为,有色甲鐕,。生成颜色随所用试剂和条件不一样而定，多为蓝色或红色。,（二）四氮唑比色法,甾体激素类药物的分析,第35页,（一）方法原理,雌激素含量测定，曾经广泛应用,Kober,反应,。该法是雌激素在硫酸作用下，经过质子化、分子重排、脱氢等作用形成共轭多烯而显色。,（三）,Kober,反应比色法,甾体激素类药物的分析,第36页,反应分为以下两步:,被硫酸氧化而形成,黄色,产物；,加水或稀硫酸稀释后继续氧化最终形成,红色产物,。,（二）测定方法：炔雌醇片,甾体激素类药物的分析,第37页,本类药品,药代学研究,、,生物利用度研究,及,违禁药品监测,等均需测定生物样品中甾体激素药品。,生物样品中本类药品分析要求方法专属性强、灵敏度高，,因本类药品给药剂量小，血药浓度很低（,ng,级或更低）。体内有内源性甾体激素，故测定方法多采取,GC、HPLC,法测定，尤其是采取,GC-MS、HPLC-MS,法。使用,MS,作为检测器，分析方法专属性和灵敏度更高。,采取,GC-MS,法对诺龙等19种蛋白同化激素人体代谢进行了研究。,书本,P261,有蛋白同化激素(,GC-MS,)及孕激素（,HPLC,）测定举例。,四、生物样品中甾体激素分析,甾体激素类药物的分析,第38页,几个测定方法特点及其应用,甾体激素类药物的分析,第39页,方法名称,测定基团,主要试剂,甾体类别,高效液相色谱法,4,-3=O,或芳香,A,环,C,18,柱,甲醇（乙腈）水,各类甾体激素,紫外分光光度法,4,-3=O,或,1，4,-3O,A,环为芳香环,溶剂（无水乙醇、乙醇、甲醇）,肾上腺皮质激素,雄性激素,雌性激素,口服避孕药,四氮唑比色法,C,17,醇酮基,三苯,四氮唑盐,四氮唑盐,氢氧化四甲基铵,肾上腺皮质激素,异烟肼比色法,4,-3=O,或,1，4,-3O,异烟肼,盐