临床检验中的发光免疫分析讲解

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,临床检验中的发光免疫分析原理、优势和值得留意的问题,北京大学医学部争论员,中国生物物理学会光生物学专业委员会副主任委员,国际生物发光和化学发光学会(ISBC学术理事,Council member of scientific advisory board of,International Society on Bioluminescence&Chemiluminescence,杨晓林,由于化学反响通常是氧化或生物化学反响产生电子能级处于激发态的物质，后者通过跃迁释放能量并产生光子，从而导致的发光现象。与荧光最大的区分在于无需激发光，因此后者也被称为光致发光。,发光Luminescence化学发光Chemiluminescence生物发光Bioluminescence,生物发光和化学发光均属于冷光，即发光不是由于发光体温度上升所致，因此其反响能量绝大局部用于发光而不是发热，放射波长也与温度无关。,发光测定属放射光谱分析，多承受动力/速率法或积分法，无需终止反响，也不受朗伯-比尔定律限制；,而酶标显色测定属吸取光谱分析，多承受终点法，需终止反响，并受朗伯-比尔定律限制。,按化学反响类型,化学发光的分类,酶促化学发光：,辣根过氧化物酶系统,碱性磷酸酶系统,黄嘌呤氧化酶系统,非酶促化学发光：,吖啶酯系统,草酸酯系统,三价铁-鲁米诺系统,闪光Flash:,按发光持续时间,发光时间在数特别钟以上，如：,HRP-Luminol系统,AP-AMPPD系统,黄嘌呤氧化酶系统,无须原位进样、以速率法测量。,发光时间在数秒内，如吖啶酯,以原位进样(In Situ Injector)和时间积分法测量,辉光Glow:,时间,发光信号,辉光坪区,速率法测量,原位进样,积分法测量,闪光尖峰,闪光与辉光及其测量方式的差异,鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统,H,2,O,2,+,NH,2,O,O,NH,NH,N,2,OH,-,HRP,NH,2,CO,2,-,CO,2,-,+Photon(425nm),R,OH,R,OH,N,S,R,B,OH,OH,增强剂,（Enhancer）,商业化产品中常见的化学发光系统一,AMPPD及其衍生物的化学发光系统,+,*,光子(477nm),AP,O,O,OCH,3,OPO,3,2-,O,-,O,O,OCH,3,O,O,-,O,OCH,3,商业化产品中常见的化学发光系统二,CH,3,C=O,O,R,N,+,OH,-,H,+,H,2,O,2,+H,2,O,+,R,OH,光子+CO,2,+,CH,3,C=O,O,R,N,HO,CH,3,C=O,O,R,N,HOO,CH,3,O,N,CH,3,O,N,C=O,O,商业化产品中常见的化学发光系统三,吖啶酯化学发光系统,发光检测的剂量-反响关系曲线,信号强度Y,实际曲线,标记物浓度X,理论/校正曲线,由于：不同发光体系和免疫分析模式具有不同的实际信号曲线,因此：科学准确的特定校正技术是衡量设备和试剂匹配性的关键,发光信号检测,光敏二极管、光敏电池、光电偶合器CCD,构造简洁、性能稳定,但灵敏度低、线性范围较窄。,主要特点,原理：,光信号,光电转换器件,电压或电流信号,放大,单光子计数器是目前高灵敏度,发光的核心部件,光电倍增管,高压,高速放大器,高速比较器,高速分频器,发光样品,产生光子,激发光阴极,产生光电子,在阳极上形成较强信号,脉冲信号,相对发光单位,数字脉冲(RLU),在各打拿极之间得到,能量和数目的倍增,单光子计数器的工作特性,光子计数Y,发光强度X,饱和点,理论/校正曲线,实际计数曲线,由于：单光子计数是在检测随机光子大事,因此：随光子数量增多检测效率持续下降,所以：准确的校正技术是设备品质的关键,模拟光电流测量曲线,单光子计数式发光检测仪,计,算,机,打,印,机,发光仪掌握模块,发光仪执行模块,掌握器,程控高压,计数/贮存器,单光子计数器,样品运动/定位装置,程控自动门锁及检测装置,原位注射泵,光生物学技术的应用范围,军事侦测,公安稽查,卫生检疫,药物筛查,医学诊断,环境检测,航天遥感,生命科学,已成为现代生物技术最活泼的领域之一,光生物学检测技术的优越性,彻底消退了放射性危害,无半衰期限制，试剂稳定性和有效期大大延长,简洁实现连续、动态、重复测定,适合于复合标记系统进展多指标并行测定,操作简洁，反响速度快，简洁实现自动化,灵敏度和线性范围超过以往技术,几种标记/检测技术理论极限灵敏度的比较,酶标,荧光,放免,发光,灵敏度(mol/L),10,-18,10,-15,10,-12,10,-9,几种标记/检测技术理论线性范围的比较,酶标,荧光,放免,发光,线性范围,10,5,10,4,10,3,10,2,几种标记/检测试剂的有效期比较,酶标,荧光,放免,发光,有效期月,18,15,12,9,6,3,0,0,20,000,40,000,60,000,80,000,100,000,试剂盒,仪器,特殊防护,治理污染,人民币,人民币,三种免疫测定技术的本钱及费用,三种免疫测定技术的本钱及费用,放免,酶标,发光,夹心法的剂量-反响关系曲线,信号强度Y,线性范围,待测物浓度X,Hook(前滞,)效应,分析灵敏度最低检测限95%可信度：,S0+2SD在该曲线上所对应的浓度值。,功能灵敏度：,测定误差变异20%的最低可检测浓度。,线性范围：,分析功能灵敏度-变异20%的最高检测浓度,相关系数0.99的曲线范围,竞争法的剂量-反响关系曲线,待测物浓度 X,信号强度 Y,线性范围,分析灵敏度最低检测限95%可信度：,S0-2SD在该曲线上所对应的浓度值,功能灵敏度：,测定误差变异20%的最低可检测浓度,线性范围：,分析功能灵敏度-变异20%的最高检测浓度,相关系数0.99的曲线范围,发光免疫分析技术,的现状及应留意的问题,商品化光生物学标记检测技术性能比较,技术类型,标记、反应体系,主要优点,主要不足,化,学,发,光,酶促,过氧化物酶、鲁米诺、氧化剂、增强剂等,测量方式简单（速率法）成本较低、灵敏度较高,工作曲线随时间漂移低端斜率呈非线性下移,螺旋金刚烷环氧化物、碱性磷酸酶,测量方式简单（速率法）灵敏度较高,非酶促,吖啶酯、过氧化氢,灵敏度较高,试剂成本高、发光时间短测量方式复杂（积分法）需原位进样(In Situ Injector)仪器成本及维护费用较高试剂成本较高,时间分辨荧光,铕（Eu）、镝(Dy)、钐（Sm）、铽（Tb）、等络合物脉冲光源激发,灵敏度较高、试剂较稳定,测量方式复杂（脉冲激发、间歇式测量、流动池）仪器成本及维护费用高环境及样品中同类元素可导致本底干扰,电化学发光,钌(Ru)的络合物脉冲电场激发,化学发光：Chemiluminescence,时间区分荧光也称时间延迟光致发光Time Resolved FluorescenceTime Delayed Photoluminescence,标记物为稀土元素络合物，通常承受解离增加荧光免疫分析DEFIA,电化学发光也称场致发光ElectrochemiluminescenceElectroluminescence标记物为稀土元素络合物,例如：电化学发光TSH检测试剂的分析灵敏度为0.005mIU/L,第四代化学发光TSH检测试剂的分析灵敏度为0.001mIU/L,缘由在于抗体的亲合力，而不是检测技术。,抗体筛选、干扰屏蔽，生产工艺、治理水平和技术效劳是打算产品性能的关键,某些产品宣称的灵敏度远超过免疫反响的理论极限10-19mol/L,即：六个待测物分子/100ul样品,就发光分析而言，制约灵敏度的瓶颈在于抗体亲合力和干扰因素，而不是检测技术。,所以，片面宣扬检测技术灵敏度和线性范围的强弱，不仅毫无意义，而且也是荒唐的。,商品化发光免疫分析产品的某些宣传误区,C肽,胰,岛,素,免疫源性胰岛素,胰,岛,素,胰岛素原,真胰岛素,胰岛素,针对掩蔽性抗原,抗体选择胰岛素,多抗或无选择性单抗,亚,单,位,亚,单,位,亚,单,位,一般HCG,亚,单,位,HCG,亚,单,位,亚,单,位,HCG游离亚单位,亚,单,位,X,抗体选择HCG,(TSH、PRL、LH、FSH类似),多抗或无选择性单抗,针对掩蔽性抗原,亚单位特异,亚单位特异,亚单位特异,亚单位特异,结合蛋白,PSA,总PSA,PSA,游离PSA,抗体选择游离PSA,针对掩蔽性抗原,针对非掩蔽性抗原,与结合和游离,PSA,等分子结合,小分子性激素测定方法的进展,削减,结合蛋白,类似物,前体,代谢产物,干扰,直接测定法,经典方法,消化样品,萃取有机相,分子筛柱分别各类甾体,测定,血清直接测定,+,高特异性单抗,+,结合蛋白屏蔽技术,男女性激素和皮质激素均来源于共同的前体和合成、代谢途径，其构造也特别相像；而且普遍与血清中的某些蛋白结合。,因此，皮质功能紊乱、肝肾功能紊乱、某些遗传缺陷、血清蛋白特别、服用类固醇药物等均可造成这些激素测定结果的特别。,游离甲状腺激素测定方法的进展,常见甲功指标：,TSH、FT,3,、FT,4,、TT,3,、TT,4,对甲亢的诊断价值依次为：,TSH=FT,3,FT,4,TT,3,TT,4,对甲低的诊断价值依次为：,FT,4,=TSHTT,4,FT,3,TT,3,但FT,3,、FT,4,灵敏度要求高，且易受干扰,发光法提高了灵敏度，使得其临床应用普遍性超过TT,4,和TT,3,两步法,操作时间长,灵敏度差,准确性差,类似物法,操作时间短,灵敏度较好,准确性较好,反向竞争法,标记抗体,操作时间短,灵敏度更好,准确性更好,第一代放免,其次代,第三代,血清FT3、FT4试剂盒的进展,消退结合蛋白对测定的影响,测定游离激素的参考方法“金”标准：平衡透析法透析液过多可导致测值偏高,操作简单、采样量大，不适于临床常规,游离激素测定法的试金石稀释试验,以游离T4为例,样品稀释20倍以内测值无明显变化,应扣除试验本身对样品的稀释度并留意基质效应,建议用6-8%BSA稀释,FT,4,+TBG,K,T,4,TBG,游离 T,4,游离结合蛋白,结合常数,结合T,4,其中：K=,由于绝大局部T4呈结合状态，因此：T4TBGTT4(总T4);TBG总TBGTT4,故，K,所以，样品被稀释N倍后，,T,4,TBG,FT,4,TBG,TT,4,FT,4,(,总TBGTT,4,),(固定常数，不变),TT,4,K,(,总TBGTT,4,),TT,4,/N,K,(,总TBG,/N,TT,4,/N,),FT,4,=,TT,4,/N,K,(,总TBGTT,4,),/N,=,TT,4,K,(,总TBGTT,4,),相 同,即，FT,4,发光技术,临床免疫分析划时代的进步,以TSH(促甲状腺素)为例,第一代,TSH检测试剂盒,一般放免,功能灵敏度1-2mIU/L,根本无法测到正常值,下限以下的血清TSH,对甲亢的诊断意义不大,固相放免,功能灵敏度,在甲亢的诊断中,开头发挥作用,其次代,TSH检测试剂盒,发光免疫,功能灵敏度,成为甲亢诊断的,首选指标之一,新型发光免疫,功能灵敏度,更新了局部临床概念,改写了甲功的调控理论,第三代,TSH检测试剂盒,第四代,TSH检测试剂盒,目前商品化发光免疫分析产品的几个特点,大多承受全自开工作方式，局部承受微孔板半自动方式,多承受磁性或非磁性微粒包被，以增加外表积，使反响时间缩短,使用内建标准曲线加校正的方法产生工作曲线,局部产品承受流淌池测定方式(适合于闪光型发光或电化学发光),流淌池检测方式示意图,检测器,检测池,负压泵,废液,四通阀,冲洗液,样品管,计量泵,枯燥空气,原位进样泵,氧化剂,优点：构造简洁，运行本钱低,缺点：易产生穿插污染，工作效率受限,标准化自动化免疫分析系统对试剂盒的技术要求,对仪器的要求：构造简洁、运行效率高、故障率低、维护费用少,对试剂盒的相应要求：标准化、成套化、简洁化，具体为：,反响/洗涤/测定条件全都；操作步骤少且趋于全都,反响时间短；通用成分多