赋予受体细胞相应抗生素抗性--课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三节基因工程简介,知识目标：,1 简述基因工程的概念,2 简述基因操作的三种基本工具的作用,3 简述基因工程的原理和基本操作程序,4 举例说出基因工程所取得的成果和发展前景,第三节基因工程简介知识目标：,1,基因工程的基本内容,基因操作的工具,基因操作的基本步骤,基因工程的成果与发展前景,基因工程与医药卫生,基因工程与农牧业、食品工业,基因工程与环境保护,基因工程的基本内容,2,精品资料,精品资料,3,你怎么称呼老师？,如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？,你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？,教师的教鞭,“不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘”,“太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早”,赋予受体细胞相应抗生素抗性-课件,4,新课标：普通高中课程标准实验教科书,科技探索之路 基础理论和技术的发展催生了基因工程,1.1DNA重组技术的基本工具,1.2基因工程的基本操作程序,拓展视野 历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献,1.3基因工程的应用,拓展视野 神奇的基因芯片,1.4蛋白质工程的崛起,选修3 现代生物科技专题,专题1 基因工程,新课标：普通高中课程标准实验教科书科技探索之路 基础理论,5,基础理论和技术的发展催生了基因工程,基因工程理论上三大突破：,（1）,DNA是遗传物质,1943 美 Avery 肺炎双球菌的转化实验等。,（2）,DNA双螺旋结构,1953 美 Watson 英Crick DNA双螺旋模型；1958M.Meselson&F.Stahl用实验证明了半保留复制，,不同基因具有相同的物质基础。,（3）,64个密码子破译和中心法则的确立,1958 Watson and Crick 提出中心法则，阐明了遗传信息的流动方向，,多肽与基因之间存在对应关系。,密码形式使遗传学在分子水平上得到解释，,密码子是通用的,基础理论和技术的发展催生了基因工程,6,（3）蛋白组分析,蛋白质合成后，还要进行磷酸化、糖基化、除去末端氨基酸、蛋白质剪切等翻译后修饰，仅从核酸的序列并不能完全描述一个蛋白质。尽管分析不同细胞类型中表达的蛋白已近20年，直到1995年才由Wilkins和Williams提出一个与基因组相对应的名词蛋白组分析的核心技术是蛋白质双向电泳。,技术上三大发明：,（1）,基因转移载体的发现,1967，T.F.Roth&D.R.Helinski，发现质粒的自我复制能力，并能够在细菌之间转移,。,基因是可以转移的。,（2,）,工具酶的发明,1972 H.C.Smith、W.Arber&D.Nathans从流感嗜血杆菌中分离得到限制性内切酶；1970年，逆转录酶的发现使真核细胞的 基因制备成为可能；此后，多种限制酶和连接酶发现。,基因是可切割的。,（3）,DNA体外重组的实现,1972年，美 Berg 第一次构建出了体外重组DNA分子。,重组DNA表达实验的成功,1973，H.Boyer&S.Cohen选用仅含单一EcoRI酶切位点的载体质粒pSC101，使之与非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段重组。重组的DNA转入大肠杆菌DNA中，转录出相应的mRNA。,基因工程诞生元年,（3）蛋白组分析技术上三大发明：,7,H.Boyer&S.Cohen,H.Boyer&S.Cohen,8,技术进一步推动基因工程的发展：,（1）,第一例转基因动物和转基因植物问世,1980 科学家通过显微注射培育出世界第一个转基因小鼠。1983，科学家采用农杆菌转化法，培育出世界上第一例转基因烟草。,（2,）,PCR技术的发明,1988年，美 K.Mullis发明PCR技术，使基因工程进一步发展。,The Nobel Prize in Chemistry 1993,for his invention of the polymerase chain reaction(PCR)method,Kary B.Mullis,La Jolla,CA,USA,技术进一步推动基因工程的发展：The Nobel Prize,9,4基因工程的发展历史,1）1972年美国Berg,Jackson等人将,基因工程的发展历史,1）1972年美国Berg,Jackson等人将猿猴病基因组SV40DNA,噬菌体基因，大肠杆菌半乳糖操纵子，体外重组获得成功。,2）1973年美国斯坦福大学Cohen,Boyer等，在体外构建含有四环素，链霉素两个抗性基因的重组质粒分子,导入大肠杆菌后稳定复制，赋予受体 细胞相应抗生素抗性。-（宣告基因工程诞生）,3）1978年美国Genentech公司利用重组大肠杆菌合成人胰島素的先进生产工艺 -（揭开基因工程产业化的序幕）,4）1983年，携带有细菌新霉素抗性基因的重组Ti质粒转化植物细胞获得成功 -（高等植物转基因技术问世）,5）1990年，美国科学家对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷患有重度联合免疫缺陷症的儿童进行基因治疗获 得成功。-（分子医学新纪元）,6）1991年，美国倡导在全球实施人类基因组计划，用15年时间斥资 30亿美元，完成12万5000个人类基因的全部测序工作。,7）1997年，英国科学家利用体细胞克隆技术复制出“多利”绵,羊。-（人类可以在实验室进行复制自身的尝试）,2005年，邓宏魁，丁明孝教授克隆小白鼠在中国属首例。,4基因工程的发展历史 基因工程,10,遗传工程（基因工程）研究的意义,（1）说明两种能力,A.基因工程，它超越生物种属界限,具有跨越天然物种屏障的能力.,B.把来自任何一种生物的基因，放置在与其毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞中的能力。,（2）表明一种创造性,应用这一技术，有可能按照人们的主观愿望，创造出自然界中原先并不存在的新的生物类型。,（3）简化生物物种进化程序，加快生物物种进化速度.,（4）强调了一种事实：确定的DNA小片段在新寄主细胞中进行扩增的事实可以制备到大量纯化的DNA片段.,（5）从而拓宽了分子生物学的研究领域。,赋予受体细胞相应抗生素抗性-课件,11,“工欲善其事，必先利其器”,DNA重组技术的基本工具,限制性内切酶基因的剪刀,DNA连接酶基因的针线,运载体基因的运输工具,“工欲善其事，必先利其器”限制性内切酶基因的剪刀,12,1.限制性内切酶,(Restriction Endonuclease),概念,l,存在于任何一种原核细菌中.,l,识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下，使,位点上催化双链DNA分子的磷酸二酯键断裂,切割产生5-P、3-OH分子,切割成两种末端：平端和粘端,l,各种生物呈现特征性的限制性内切酶酶切图谱.识别特定序列,l,在生物分类,基因定位,基因重组,疾病诊断,刑事侦察领域极为重要,1.限制性内切酶(Restriction Endonucle,13,Hamilton Smith,Daniel Nathans(USA)and Werner Arber(Switzerland)1978 Nobel prize,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978,for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics,Hamilton Smith,Daniel Nathans,14,限制性内切酶的发现：(宿主细胞的限制和修饰作用),限制：,细菌的自我保护系统病毒的侵染,修饰：,修饰系统防止自杀,（1）两种不同来源的入-噬菌体入K，入B；,（2）能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞 K株，B株,（3）当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。,（4）一但 入K 噬菌体在B株成功，由 B 株繁殖出 入K 后代，能感染 B 株,不能感染原来 K株.,限制性内切酶的发现：(宿主细胞的限制和修饰作用)（1）两种,15,限制性内切酶对抗外来DNA,细菌细胞,病毒,病毒DNA,限制性内切酶,病毒注入DNA分子,限制性内切酶切割入侵的DNA,切 割,限制性内切酶对抗外来DNA细菌细胞病毒病毒DNA限制性内切酶,16,修饰酶,Eco,R I修饰酶,加甲基,修饰酶EcoR I修饰酶,17,赋予受体细胞相应抗生素抗性-课件,18,特点,1）识别序列：4，5 或 6个碱基对,EcoR I识别 5-G/AATTC-3 序列,3-CTTAA/G-5,2）180度旋转对称回文结构，对称轴在第三，四碱基之间。,3）任何一个DNA分子，每9对碱基出现一个II类酶切口。,特点,19,限制性内切酶及其缓冲液,限制性内切酶及其缓冲液,20,赋予受体细胞相应抗生素抗性-课件,21,2.DNA连接酶,（DNA ligase）,DNA双链分子上相邻3羟基和5磷酸基团共价结合，形成3-5磷酸二酯键，使原来断开的缺口重新连接起来。,DNA片断怎么连起来？,2.DNA连接酶（DNA ligase）DNA双链分子上相邻,22,3.运载体,载体的三大功能：,1）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。,2）为外源基因提供在受体细胞的的复制能力或整合力。,3）为外源基因提供在受体细胞的的扩增和表达能力。,用什么方法将目的基因送入细胞？,假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样,“分子运输车”应该具备什么特点？,3.运载体载体的三大功能：1）为外源基因提供进入受体细胞的,23,理想载体具备四个条件：,1)具有对受体细胞的可转移性，提高导入细胞的效率。,对受体细胞无害、易分离。,2)具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点，使外源基因在受体细胞中稳定遗传。,能自我复制,3)具有多种单一的限制性内切酶识别切割位点，有利于外源基因的拼接插入,有切割位点,4)具有合适的选择标记（报告基因），便于DNA重组分子的检测。,有遗传标记基因,4.36,(kb),大肠杆菌源质粒；含复制起始位点，能在大肠杆菌中高拷贝复制；含氨卞青霉素抗性基因（Amp,r,）和四环素抗性基因（Tet,r,）选择标记基因，对重组子进行筛选；含多个限制性内切酶酶切位点；克隆载体；,理想载体具备四个条件：1)具有对受体细胞的可转移性，提高导,24,载体有两个抗药性基因，插入失活一个抗药性基因，而在另一个基因筛选标记存活的是转化子，在插入失活的基因筛选标记中不存活的是转化子。,载体有两个抗药性基因，插入失活一个抗药性基因，而在另一个基因,25,质粒的构建与改造,1)删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片段装载量。,2)灭活某些质粒的编码基因。,3)加入易于识别的选择标记基因。,4）选择标记基因内引入内切酶的识别及酶切位点的序列多克隆接头(Polylinker)。,5)加入特殊的基因表达调控元件。,质粒的构建与改造,26,实验：模拟重组DNA,实验：模拟重组DNA,27,入-双链噬菌体,由头部外壳蛋白和 48.5 kb 双链DNA 组成，,入-DNA两端各有一个12碱基组成互补单链,称cos末端，cos 末端将DNA引入头部，,噬菌体的头部空壳蛋白对 入DNA 的包装与其序列无关,只识别COS位点,。,固体平板培养基出现透明斑点（噬菌斑）.液体,培养液由 混浊变澄清,，说明大肠杆菌完全被裂解。,噬菌斑是经过若干裂解周期形成宿主菌死亡区域。,入-双链噬菌体 由头部外壳蛋白和 48.5 kb 双,28,提取目的基因,目的基因与运载体结合,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测和表达,基因工程的基本操作程序,提取目的基因基因工程的基本操作程序,29,基因工程的基本过程,1)切 用限制性内切酶切开外源基因和载体分子。,2）接 用连接酶将外源基因连接到载体分子上。,3）转 借助细胞转化将DNA重组分子导入细胞。,4）增 培养转化细胞，扩增DNA重组分子。,5）检 筛选和鉴定转化细胞及目的基因。,基因工程的基本过程,30