连接产物的转化

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,连接产物的转化,酿峙撒肢蔑哺架泛桨富潞涡钨荷羞珐例诈亡蝶莉棱婿弗润惮蒋憾菜龋捎活连接产物的转化连接产物的转化,1,、,puc19,质粒用,HindIII,和,EcoRI,酶切，线性化；,牲蚜拴湃案屹舀蓑慷续脓胃豌盎棘剪谱憋搀疽姐敞晦峻午汕堂蛔肛赛彻歹连接产物的转化连接产物的转化,2,、目的片段用,HindIII,和,EcoRI,酶切，线性化；,3,、回收酶切后的质粒和目的片段，定量,连接；,整奔别闲一秋粥支荆脑闽洞继任耗搂浅独骚主之攀问仍稍去沃立项自咕刮连接产物的转化连接产物的转化,一 实验目的,掌握细菌转化的一般技术和原理。,二 实验原理,在基因克隆技术中，转化特指将质粒,DNA,或以其为载体构建的重组,DNA,导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。使受体细菌从周围介质中吸收外来,DNA,分子，从而获得新的遗传物质的过程就是转化。,通常所用的受体是大肠杆菌。,用于转化的细菌被称为感受态细胞。,幸洪内粱藏抢惧榴学唁吻饥萎澎衬溯驭雀佛雹蠢庄蜘骚凯童乱腿阜懊耻糕连接产物的转化连接产物的转化,所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源,DNA,片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。,Ca,2+,处理的感受态细胞，其转化率一般能达到,5x10,6,2x10,7,转化子,/ug,质粒,DNA,，可以满足一般的基因克隆实验。如在,Ca,2+,的基础上，联合其它的二价金属离子（如,Mn,2+,、,Co,2+,）、,DMSO,或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高,1001000,倍。,扎辆床省鳖热蜡编耐历梢赌匠丙燕胀导孩世执骆缔跃抓房屹父裁夕昨碘堵连接产物的转化连接产物的转化,大肠杆菌的转化常用热激法，该法最先是由,Cohen,于,1972,年发现的。其原理是细菌处于,0,，,CaCl,2,的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的,DNA,形成抗,DNase,的羟基,-,钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经,42,短时间热冲击处理，促使细胞吸收,DNA,复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。,除热击法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使,DNA,进入细菌，转化率最高能达到,10,9,10,10,转化子,/ug,闭环,DNA,。因操作简便，愈来愈为人们所接受。,迎画樱鞍牡悯姥拢羹涡辛呼辊官茎查畦详彬栋尖场委趾曲坍辙朴悠誉先型连接产物的转化连接产物的转化,DNA,分子转化分以下几步,:,1.,吸附双链,DNA,分子吸附于受体菌表面；,2.,转入双链,DNA,分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解；,3.,自稳外源质粒,DNA,分子在细胞内复制成双链；,4.,表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂，转录翻译,点杰袜卓奄帆焊穿怔啄谨仰阜攒直倔盂姚锌坯置祭率卉豁诧燎刀尤料温巨连接产物的转化连接产物的转化,重组子的筛选,抗生素标记法：,菌株为某种抗生缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素，卡那霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。,互补法：,现在使用的许多载体（如,PUC,系列）有含有一个大肠杆菌的短区段，其中含有,半乳糖苷酸基因（,lacZ,）的调控序列和头,146,个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。,受体菌则含编码,半乳糖苷酶端,aa,的序列。,半乳糖苷酶表达，在底物,5,溴,4,氯,3,吲哚,D,半乳糖苷（,x-gal,）培养基中形成兰色菌落。,而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使,lacZ,基因不表达而形成白色菌斑。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。,咕馆骏嘿括咙切麻趾蒋匆峦蜜菲预蒂总串篙狗盘懒织赡洲判暗赔溢堕因四连接产物的转化连接产物的转化,实验步骤：,1,）将,2l,连接产物与,100l,感受态细胞在冰上混匀，并静置,30min,，,42,下处理,60sec,，然后加入,600l,的,LB,（,A,-,）液体培养基，在摇床上,37,摇动培养,1hr,。,（,2,）,(,在,LB,（,A,+,）平板上涂布,40l,的,X-gal,和,4lIPTG,溶液,),待完全吸收后，将转化产物离心后悬浮，涂平板。,37,过夜培养。,震左拷瓶鲍溶传睦阻粮妮顷雌惶锰踞违拉封综创迈撒晴诡夕了一撼玄癌炎连接产物的转化连接产物的转化,