圆二色谱仪操作规程培训

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,JASCO J-1500,圆二色谱仪操作培训,-,食品科技学院 中心实验室 唐老师,目 录,1,、,圆二色谱仪基本原理与应用,2,、,JASCO J-1500,基本组成与附件,3,、开机与基本操作规程,4,、数据分析,5,、关机与试验注意事项,1,、圆二色谱仪基本原理,平面偏振光的电向量,E,起偏振器,自然光的电向量,E,椭圆偏振光,：,两束偏振光的振幅,(,强度,),不相同,圆二色性,(CD),：活性物质对左、右旋圆偏振光的吸收率差值，将传播的左右圆偏振光变成椭圆偏振光。,两束互相垂直，振幅相等的平面偏振光，其位相相差,1/4,波长时，合成圆偏振光。,圆二色性,(CD),的表示：,CD,单位转换方法：,http:/www.eryi.org/blog/post/circular-dichroism-units-conversion.html,Ellipticity,（椭圆率,）,：,mdeg,，定义单位，仪器测定直接显示,CD,图,y,坐标。,Mean residue ellipticity or,Molar ellipticity(,摩尔椭圆率,),：单位为,deg.cm,2,.dmol,-1,，文献中通常都使用,根据,Beer-Lambert law,有：,=,.,l.c,或,=,mdeg/(l.c)(c-,摩尔浓度,),计算出的值最后再乘以,1000,即可转换为,deg.cm,2,.dmol,-1,对于,蛋白质,，使用的是,mean residue ellipticity,。由于,mean residue molecular weight=protein formula weight/number of residues.,摩尔圆二色性为摩尔消光系数的差值（,delta epsilon,），即：,=LCP-RCP,在分子模拟中通过高斯理论计算,CD,光谱时，得到的结果通常是以,摩尔圆二色性,表示,。,与摩尔椭圆率（,molar ellipticity,）,之间的转换：,=3298.2,CD,光谱与,ORD,光谱,：,同时产生，包括同样的分子结构信息，光学活性物质分子中的不对称生色团。,CD,反应光与分子间能量的转换，旋光性则是与分子中电子的运动有关。,差异：,CD,比,ORD,容易辨别重叠峰，易检测弱吸收带、更容易拟合、能够提供较多意义明确的信息。,旋光性,(ORD),：光学活性分子对左、右圆偏光的折射率不同，透射光仍然为平面偏振光，但其旋转了一定的角度（旋光度）。,圆二色谱仪应用：,蛋白质折叠研究,蛋白质构象研究,DNA/RNA,相互作用,酶动力学研究,有机立体化学研究,光化学物质纯度检测,药物量的分析,天然有机化学,生化和大分子,金属复合物化学,医学,农业化学,物理化学,快速扫描实验,通过,CD,光谱可用于分析诸如,核酸、蛋白质、多糖等生物大分子光活性物质,的空间结构。,蛋白质：,氨基酸的圆二色性：在可见光区没有吸收，紫外区只有芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。,2,、,JASCO J-1500,基本组成与附件,配置：,1,）检测器：,UV-VIS,163-950nm,NIR,400-1250nm,2),光源：,氙灯,3),气体：高纯,N2,4),多通道,测定（,CD/HT/Abs,），,CD,测定范围：,20,200,2000,10000 mdeg,5),蛋白质二级结构,分析软件,6),其他,附件,：变温支架、停流附件等,附件,1),变温样品支架（,-40130,）,石英比色皿,:1,、,10mm,石英比色皿,:1,、,2,、,5,、,10mm,附件,2),固体样品支架与积分球检测器,制样工具,可做透射法或反射法，,压片制样或直接上样,3),停流附件,注射器：,10ml,单管路死体积：,46ul,注射器,Flow rate,Max,:,5ml/min,Mixing Ratio:,整数倍,反应动力学检测,4)N2,吹扫装置,只能用于标准样品支架，用于,190nm,以下样品测试,3,、开机与基本操作规程,1,）,开气,：,打开氮气,，调节分压在,0.02mPa,左右，依据测定波长范围在仪器右侧的流量控制器中调节所需的气体流量。(190nm 2L/min;185-190nm 5-10L/min;2,时，测试不准确。适宜的,A,范围,0.6-1,。,b),控制,HT,范围在,170-700,之间,，降低,HT,方法：降低样品浓度、使用短光程长比色皿、增加带宽、注意溶剂效应。,HT700,时没有足够的光到达检测器，测试结果不准确。狭缝宽太大，,HT170,可损坏,PMT,检测器。,4,、数据分析,1,）数据类型：,2D,数据：,.jws,格式，光谱分析软件以及二级结构分析软件都是需要这种格式数据文件。,3D,数据：,.jwb,格式，需根据需要提取,2D,数据后进行相关分析。,2,）蛋白质二级结构软件分析：,CD,单位需为摩尔浓度，故需已知蛋白浓度（,mg/ml,），氨基酸残基平均分子量（未知时，一般取,110,）。,“蛋白质中,20,中氨基酸的平均分子质量约为,138,，但在多数蛋白质中较小的氨基酸占优势，因此平均相对分子质量约为,128,。又因每形成一个肽键将除去一分子水（相对分子质量,18,），所以氨基酸残基的平均相对分子质量约为,128-18=110,。”,-,王镜岩版,生物化学,第三版上册,p160,2D,数据分析：,二级结构分析：,打开,protein Secondary structure estimation,软件，打开转换单位后另存的文件数据,。,3D,数据分析：,需进行,2D,数据提取后方可进行有关分析。点击,Interval Data Analysis,软件，打开,.jwb,格式,3D,数据文件。,5,、关机与测试注意事项,1,）关机程序：,关闭软件、关闭电脑和,J-1500,主机电源、关闭水循环、通气,10min,后关闭氮气,。,2,）样品架确认：,仪器开机前确认安装的是何种样品支架，若是变温支架必须先开循环水才能开机。,3,）禁止未开气体开机：,高压氙灯，使空气在,O2,变成臭氧，腐蚀光路配件表面。,4,）比色皿：,石英比色皿由于加工过程产生形变可显示圆二色性，故需使用低,CD,信号的比色皿。,比色皿清洗：保证测试重复性。禁止超声清洗，,Pierced,等专门清洗剂（清洗剂洗后建议用,2M,）、碱溶液、,50%,硝酸等。,for protein:,近紫外区使用光程长,5mm,的，远紫外区使用,1mm-0.1mm,。,End,