第7章亲和层析ppt课件

*,海南大学农学院wss,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第七章 亲和层析,Affinity chromatography,11/19/2024,1,第七章 亲和层析Affinity chromatograp,技术背景,各种大分子物质之间理化特性的差异性。,但如果这种差异性较小，纯化较麻烦，最终收得率很低。,11/19/2024,2,技术背景各种大分子物质之间理化特性的差异性。10/7/202,内容提要,第一节基本原理,第二节操作,第三节提高吸附剂的操作容量,第四节应用实例,11/19/2024,3,内容提要第一节基本原理10/7/20233,第一节 基本原理,蛋白质2与配体无生物学特异性,1,2,L,M,S,11/19/2024,4,第一节 基本原理蛋白质2与配体无生物学特异性12LMS10/,一、亲和层析的概念,亲和力,根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子,特异识别和可逆结合,的特征，将生物分子间的这种结合能力称为亲和力。,11/19/2024,5,一、亲和层析的概念亲和力10/7/20235,亲和层析法,利用生物大分子和固定相表面存在某种,特异性吸附,而进行选择性分离的一种生物大分子分离的层析方法。,11/19/2024,6,亲和层析法10/7/20236,亲和层析法的实质,是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一般反应性能的间隔臂，随后再连接配体（酶、抗原、激素等）组成固定相, 配体,高选择地吸附与其有生物特性的大分子,而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析柱，保留在柱上的分子将以纯品形态洗脱下来。,11/19/2024,7,亲和层析法的实质10/7/20237,11/19/2024,8,10/7/20238,11/19/2024,9,10/7/20239,11/19/2024,10,10/7/202310,二、,亲,和层析法的作用机理,固相载体,(1),(2),(3),A,B,Sample,Washing,Elution,X,B,亲,和基团,配体,X,B,A,A,11/19/2024,11, 二、亲和层析法的作用机理固相载体(1)(2)(3)ABS,11/19/2024,12,10/7/202312,特异性配体亲和层析法和,通用性配体亲和,层析法：,方法,配体,性能,特异性配体亲和层析法,复杂的生命大分子物质（如抗体、受体和酶的类似底物等）,具有较强的吸附选择性和较大的结合力,通用性配体亲和层析法,简单的小分子物质（如金属、染料、以及氨基酸等）,成本低廉，具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率,11/19/2024,13,特异性配体亲和层析法和通用性配体亲和层析法：方法配体性能特异,三、亲和层析具备的三要素,介质(基质),具有活化基团,间隔臂,连接介质与配体的分子,配体,具有识别能力,反配体（分离物）,与配体进行可逆结合,11/19/2024,14,三、亲和层析具备的三要素介质(基质)具有活化基团10/7/,四、,亲,和层析法的四要点,(2),Specific,Binding,Substance (S),溶 解,Elution,(4),配 体,Ligand (L),偶,合反应,(3),Coupling Reaction,杂 质,S,S,S,S,(1),Solid Matrix,S,11/19/2024,15, 四、亲和层析法的四要点(2)Specific溶 解配 体,五、亲和层析的特点,条件温和：,不影响样品的生物活性，适合生物大分子的操作。,纯化效率高：,一步法分离和纯化混合物中的样品，提纯达几千倍,得到高纯度样品。,选择性强：,依据生物学特异性，而非物理化学性质分离原理。故特异的,层析图为2个峰,，第1个为杂峰，第2峰为纯品。,11/19/2024,16,五、亲和层析的特点条件温和：不影响样品的生物活性，适合生物大,Activity,典型的亲和层析操作：,Elution volume,Protein,pH 2.05,*,11/19/2024,17,Activity 典型的亲和层析操作：Elution vo,五、亲和层析的特点,柱层析柱小 Vt11.5ml。上样量大,达 1/2Vt体积并对样品的浓度与纯度要求不高。,操作简单，时间快速。,柱子填充载体昂贵，配体的特异性，有时找不到适宜的配体，不适合所有生物大分子样品。,PriboFast黄曲霉毒素B1免疫层析亲和柱,11/19/2024,18,五、亲和层析的特点柱层析柱小 Vt11.5ml。上样量大,内容提要,第一节基本原理,第二节操作,第三节提高吸附剂的操作容量,第四节应用实例,11/19/2024,19,内容提要第一节基本原理10/7/202319,二、配基（配体）的选择,第二节 操作,一、理想基质的性质,优良的配体必须具备两个条件：,配体与生物大分子具有合适的亲和力；,配体具有与载体牢固地结合，又不影响与生物大分子之间的亲和力。,11/19/2024,20,二、配基（配体）的选择第二节 操作 一、理想基质的性质优良,常用配体,分离对象,酶蛋白,基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等,抗 体,抗原、病毒、细胞,外源凝集素,多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白,核 酸,互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合蛋白,激素及维生素,受体、载体蛋白,细 胞,细胞表面特异性蛋白、外源凝集素,专一性结合的生物体系,11/19/2024,21,常用配体分离对象酶蛋白基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等,配体,待纯化的蛋白质,配体,待纯化的蛋白质,抗原,特定单克隆抗体或多克隆抗体,肝素,凝聚因子、脂酶、结缔组织蛋白酶、DNA聚合酶,单克隆抗体,特定抗原,胆固醇,胆固醇受体、胆固醇结合蛋白,蛋白质A/蛋白质G,免疫球蛋白,脂肪酸,脂肪酸结合蛋白、白蛋白,蛋白酶抑制剂,蛋白酶,核苷酸,核苷酸结合蛋白、需核苷酸的酶,磷酸,磷酸酶,苯基硼酸盐,糖蛋白,三嗪染料,脱氢酶、激酶、聚合酶、限制酶、干扰素,凝集素,糖蛋白,抗生物素蛋白,含生物素的酶,糖,凝集素、糖苷酶,蛋白质亲和层析中的合适配体,11/19/2024,22,配体待纯化的蛋白质配体待纯化的蛋白质抗原特定单克隆抗体或多克,三、亲和吸附剂的制备,载体的活化,（,CNBr）,配体的偶联,结合能力的测定,用溴化氰活化载体,11/19/2024,23,三、亲和吸附剂的制备载体的活化（CNBr）用溴化氰活化载体1,11/19/2024,24,10/7/202324,四、,特异性吸附,欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力较强时，配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入，亲和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密的复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。影响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有关。,复合物带,11/19/2024,25,四、特异性吸附 欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力,样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，除了与它们之间的亲和力有密切关系外，还与样品的,pH值和离子强度,有关系。,11/19/2024,26,样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，除了与它们之间,五、层析步骤,样品制备 结合步骤 装柱操作,流速控制 洗脱方法 淋洗,洗脱目标样品 柱子再生,选择配体,凝胶与配体偶联,柱子平衡,11/19/2024,27,五、层析步骤样品制备 结合步骤 装柱操作,洗脱方法,11/19/2024,28,洗脱方法10/7/202328,A.,特异性洗脱：,凡是能与配体竞争酶的游离配体，都十分强烈地影响着结合酶的洗脱过程。游离配体浓度若与配体浓度相同，则可直接从基质上洗脱小结合的酶。同时应根据酶与配体亲和力的大小确定洗脱液的浓度。,B.,非特异性洗脱：,通过改变洗脱液的条件（pH、离子强度、温度和介电常数），即能改变蛋白质的构象，降低蛋白质与配体的亲和力、不损害蛋白质与吸附剂的稳定性。,11/19/2024,29,A.特异性洗脱：B.非特异性洗脱：10/7/202329,内容提要,第一节基本原理,第二节操作,第三节提高吸附剂的操作容量,第四节应用实例,11/19/2024,30,内容提要第一节基本原理10/7/202330,第三节 提高吸附剂的操作容量,亲和吸附剂的操作容量，受以下因素的影响：,配体性质,配体在吸附剂中的含量,配体与吸附物结合时的位阻效应大小,基质的多孔性,操作条件等,11/19/2024,31,第三节 提高吸附剂的操作容量亲和吸附剂的操作容量，受以下因,一、引入间隔手臂,小分子配体直接连接于琼脂糖上会产生无效吸附，其原因是由于载体的空间位阻关系，使大分子化合物（亲和物）不,能直接接触到配,体。因此，通过在,载体与配体之间引,入适当长度的“手,臂”减少载体的空,间位阻，增加配,体的活动度。,11/19/2024,32,一、引入间隔手臂小分子配体直接连接于琼脂糖上会产生无效吸附，,对氨基苯-硫代吡喃半乳糖苷,氨乙基乙酰胺,常见的间隔臂是68个碳原子的碳氢链，基质到配体的长度为0.51nm；或用长达17个碳原子。,间隔臂:不同长度的间隔臂（B1nm），(C=2.1nm)对靶酶的亲和力的差异。,11/19/2024,33,对氨基苯-硫代吡喃半乳糖苷氨乙基乙酰胺常见的间隔臂是6,二、增加配体取代的程度,基质的活性基团增多，配体结合量增加，操作容量亦大；由于位阻效应而影响配体的偶联量，故控制偶联反应,的条件可增,加配体的偶,联数量。,11/19/2024,34,二、增加配体取代的程度基质的活性基团增多，配体结合量增加，操,三、减少结合键增加配体与蛋白质的互补效应,以蛋白质与多肽为配体时，以最少的共价键连接至载体，利于保护蛋白质的高级结构及生物活性；,控制偶联反应的pH，减少蛋白质分子与基质连接的键；位点的减少，可以结合更多的蛋白质，提高结合容量。,四、残留活化基团的封闭,封闭多余的活化基团，避免非,特异性吸附。,11/19/2024,35,三、减少结合键增加配体与蛋白质的互补效应10/7/20233,内容提要,第一节基本原理,第二节操作,第三节提高吸附剂的操作容量,第四节应用实例,11/19/2024,36,内容提要第一节基本原理10/7/202336,第四节 应用,A.不保留峰,B.脱附峰,纵坐标示吸收值,横坐标示洗脱体积,亲和层析的基础是对蛋白质进行选择性的吸附脱附，一般的结果是层析图谱上出现二个层析峰，不保留峰与脱附峰，脱附动力学一般较慢，脱附的层析峰宽而拖尾。,Ve,A280,A B,11/19/2024,37,第四节 应用A.不保留峰亲和层析的基础是对蛋白质进行选择,亲和层析应用,一、纯化特异性生物分子,1.纯化抗原、抗体及其结合物；,2.分离糖蛋白、各种凝集素；,3.含巯基蛋白质的分离；,4.用寡聚核苷酸分离核酸；,5.凝集素配体结合膜蛋白的分离技术。,11/19/2024,38,亲和层析应用一、纯化特异性生物分子10/7/202338,亲和吸附剂：基质-间隔臂-抗体(抗原)组成，用于鉴定、分离、纯化样品中的抗原(抗体),1.抗原、抗体的纯化,11/19/2024,39,亲和吸附剂：基质-间隔臂-抗体(抗原)组成，用于鉴定、分离、,Protein A对IgG类物质有较大的束缚力，加之免疫球蛋白被束缚之后仍保留了IgG束缚抗原的特性。所以利用结合IgG的Protein A-Sepharose CL-4B吸附剂还可分离特异性的抗原。,11/19/2024,40,Protein A对IgG类物质有较大的束缚力，加之免疫球蛋,2.纯化糖类分子,配体为外源凝集素的Sepharose 6B的亲和层析介质，特异地结合碳水化合物的糖类残基或糖化细胞膜组分、细胞、亚细胞结构及糖蛋白等。,11/19/2024,41,2.纯化糖类分子配体为外源凝集素的Sepharose 6B的,凝集素和糖蛋白的亲和层析分离,凝集素,是在自然界广泛存在的一大类糖结合蛋白。它们,具有不同的糖结合专一性,。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不同糖链结构的糖蛋白，可以有效地分离纯化不同型的凝集素，也可应用固定化的凝集素分离纯化各种糖蛋白。,11/19/2024,42,凝集素和糖蛋白的亲和层析分离 凝集素是在自然界广泛存在的一,不同的糖蛋白具有不同的单相组分和糖链结构，它们和不同的凝集素呈现出不同的结合能力。,常用的凝集素 ：,Con A 、LCA 对甘露糖专一,WGA 对N-乙酰氨基葡萄糖专一,11/19/2024,43,不同的糖蛋白具有不同的单相组分和糖链结构，它们和不同的,UUUUUUUUUUUUUUUUU,UUUUUUUUUUUUUUU,UUUUUUUUUUUUUUU,UUUUUUUUUUUUUUU,AAAAAAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAAAA,带PolyU (T) 的亲和吸附剂分离含PolyA尾巴的mRNA,3.分离核酸,11/19/2024,44,UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU,11/19/2024,45,10/7/202345,SDS-PAGE,4.,以亲和层析法纯化,Trypsin,：,CHOM,Trypsin,A B C&D,Disc-PAGE,A B C = D,以凝胶电泳鉴定亲和层析,操作过程各步骤的样本,Chitin,11/19/2024,46,SDS-PAGE4.以亲和层析法纯化 Trypsin：CHO,5.受体蛋白的纯化,由于受体蛋白在激素与其互补的膜结合中的重要作用，同时其含量极低，使研究受阻。利用亲和层析法分离受体蛋白成为可能。,例：胰岛素受体蛋白的纯化：将胰岛素偶联到溴化氰活化的琼脂糖凝胶，结合受体蛋白，特异性洗脱，释放出目标蛋白质。,11/19/2024,47,5.受体蛋白的纯化由于受体蛋白在激素与其互补的膜结合中的重要,6.,重组蛋白,用基因工程的方法引入,特殊结合位点,（如金属结合位点），将其加在重组目的蛋白的,氨基端或羧基端,。,紧邻结合位点的位置加入,蛋白酶切割位点,，以便在用亲和层析纯化之后，将多余的蛋白质片段去掉 。,11/19/2024,48,6.重组蛋白10/7/202348,金属螯合层析,基于蛋白质的,组氨酸咪唑基,和,半胱氨酸巯基,能与,铜,、,锌,、,镍离子,间形成稳定的,螯合物,而进行分离的。,11/19/2024,49,金属螯合层析 基于蛋白质的组氨酸咪唑基和半,7.含有辅酶的酶类的亲和层析,很多的酶中都含有不同类型的辅酶，最为常见的是氧化还原酶和脱氢酶含有NAD。为此用固定化的NAD可以分离不同类型的氧还酶和脱氢酶，或激酶。,固定化NAD柱,11/19/2024,50,7.含有辅酶的酶类的亲和层析 很多的酶中都含有不同类,8.染料配体的层析,染料树脂,不专一的亲和介质,优点:,稳定、和许多类型的酶结合，但又不被酶所作用、价格低廉。,eg. Cibacron蓝F3GA。,11/19/2024,51,8.染料配体的层析 染料树脂10/7/202351,碱性磷酸单酯酶的分离,小牛,小肠粘膜,抽提液用,DEAE离子交换纤维素,除去部分杂蛋白,酶活性的级分再上平衡的,活性染料艳蓝K-GRS,和,交联琼脂糖4B,偶联的染料层析柱,平衡液洗除杂蛋白,含有0.1mol/L磷酸盐的缓冲液,可洗脱碱性磷酸单酯酶,再吸附在,活性染料Procion红HE-33,与,交联葡聚糖凝胶G-100,偶联的基质柱上,用含有0.1mol/L磷酸盐的缓冲液对缓冲液梯度洗脱，酶活性出现在5m mol/L磷酸盐浓度时,回收率62,回收率96,11/19/2024,52,碱性磷酸单酯酶的分离 小牛小肠粘膜抽提液用DEAE离子交换纤,原理：,利用酶的活性中心具有结合配体的功能，可直接检验酶的活力；失活的酶虽然在其它方法中仍然可检测到蛋白质的存在，但对于其活性不能判断，图A，无活性则不能与亲和吸附剂结合时，从亲和柱中穿流而出；活性部分因结合，通过洗脱得到分离，图B。,A280,具有结合能力及催化活性,亲和层析,A280,穿流峰,洗脱峰,图A,图B,二、研究酶的结构与功能,11/19/2024,53,原理：A280具有结合能力及催化活性亲和层析A280穿流峰洗,思考题,在亲和层析时，为什么床休积比较小？为什么无亲和力的物质只能产生一个层析峰？,简述亲和层析的分辨率比一般吸附层析高的原因。,配体应具备哪些条件？,11/19/2024,54,思考题在亲和层析时，为什么床休积比较小？为什么无亲和力的物质,4.在操作及应用方面，亲和层析与吸附层析、离子交换层析、凝胶层析有哪些异同点？,5.在含A、B、C、D四种蛋白质组分的混合液中，A和B均为含有葡萄糖链的糖蛋白，其pI分别为5.0和5.5，而C和D分子量分别是40000和50000，试设计用层析法分离它们的方案。,11/19/2024,55,4.在操作及应用方面，亲和层析与吸附层析、离子交换层析、凝胶,