《基因克隆》课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,/10/29,.,*,基因工程及体外表达体系（,1,）,.,酶,心血管病研究所,王佐,基因工程及体外表达体系（1）.酶心血管病研究所,基因工程及体外表达体系,酶,载体,方法,基因工程及体外表达体系酶,第一节 概述,定义,基本步骤,意义,第一节 概述定义,定义：,应用酶学的方法，在体外将目的,基因与载体,DNA,结合成一具有自,我复制能力的,DNA,分子（复制,子、重组体），继而通过转化或,转染宿主细胞、筛选出含有目的,基因的转化子细胞，再进行扩,增、提取获得大量同一,DNA,分子,拷贝，或其,表达产物,。,定义：应用酶学的方法，在体外将目的,Recombinant DNA technology,Gene cloning,Molecular cloning,Gene engineering,Genetic engineering,Recombinant DNA technology,二、基本步骤,目的基因的获得；,目的基因与载体的连接；,重组,DNA,分子导入受体细胞；,筛选出含重组,DNA,分子的受体细胞克隆；,克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化。,二、基本步骤目的基因的获得；,基因克隆课件,三、意义,重组,DNA,技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟；,重组,DNA,技术缩短了进化时间；,重组,DNA,技术使人能对生物进行定向改造。,三、意义重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟；,基因克隆课件,基因工程大事记,1973 Cohen,第一例成功的克隆实验,1978 Genentech,公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物,1982,第一个基因工程药物,-,重组人胰岛素在英、美获准使用,1985,第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼,基因工程大事记1973 Cohen第一例成功的克隆实验,1993,基因工程西红柿在美国上市,1997,英国罗斯林研究所 多莉羊,1999.9,中国获准加入人类基因组计划,.,负责测定人类基因组全部序列的,1%,2000.6.26,科学家公布人类基因组工作草图,2001.2.11,公布人类基因组基本信息,生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程、干细胞,1993 基因工程西红柿在美国上市,Stanley N. Cohen,Herbert Boyer,Stanley N. CohenHerbert Boyer,“,工程,鲫”、“,工程鲤,”,“工程鲫”、“工程鲤”,基因克隆课件,多利和它的孩子,多利和它的孩子,沃尔小组成功克隆两只恒河猴,沃尔小组成功克隆两只恒河猴,吴明杰小组：,5,只克,隆猪,吴明杰小组：5只克 隆猪,基因克隆课件,基因克隆课件,第二节 重要的工具酶,限制性核酸内切酶；,DNA,聚合酶；,DNA,连接酶；,T4,多核苷酸激酶；,碱性磷酸酶。,第二节 重要的工具酶限制性核酸内切酶；,一、,Restriction Endonucleases,1,定义,限制性核酸内切酶（限制酶），是一类能识别和切割双链,DNA,分子内特定碱基顺序的核酸水解酶,。,一、Restriction Endonucleases1 定,Restriction Endonucleases,Made by bacteria and viruses.,Over,500,Restriction endonucleases exist.,These will cleave over,80 specific sequences,.,Restriction Endonucleases Made,基因克隆课件,2,分类,限制酶可分为,3,型。,I,型和,型限制酶同时具有限制与修饰两种功能,;,I,型限制酶没有固定的切割位点，随机切割产生非专一切口；,2 分类限制酶可分为3型。I型和型限制酶同时具有限制与修饰,型限制酶在,DNA,链上有特异切割位点，但其切割位点在识别位点以外。,I,型和,型限制酶在分子克隆中用途不大。通常所指的限制酶是,型酶。,型限制酶在DNA链上有特异切割位点，但其切割位点在识别位点,型酶对,DNA,水解有很强的特异性，它要求严格的顺序作为切割点。切点顺序中有一个碱基的变异、缺失或修饰，便不再被水解，因此在分子克隆中常用，它被誉为分子生物学家的手术刀。,Ex.,Eco,R G,AATT C,C TTAA,G,型酶对DNA水解有很强的特异性，它要求严格的顺序作,Agarose Gel Electrophoresis,Agarose Gel Electrophoresis,3,命名原则,H,O,Smith,和,D,Nathams(1973),提议的命名系统已被公众所接受，其命名原则如下：,3 命名原则 HOSmith和DNathams(1,从大肠杆菌（,E.,coli,）,R,菌株分离到的几种限制酶，分别表示为,Eco,R,、,Eco,R,、,Eco,R,等。,限制酶第一个字母,(,大写，斜体,),代表该酶的微生物,(,寄主菌,),属名；第,2,、,3,个字母,(,小写，斜体,),代表微生物种名。,接下来的字母代表寄主菌的株或型。,如果从一种菌株中发现了几种限制酶，则根据发现和分离的顺序用罗马字母表示。,从大肠杆菌（E.coli）R菌株分离到的几种限制,Restriction Endonuclease,Enzymes,Restriction Endonuclease,4 ,型酶作用特点,型酶有严格的识别、切割顺序，以内切方式水解双链,DNA,中的磷酸二酯键，产生的,DNA,片段,5,端为,P,，,3,端为,OH,。,4 型酶作用特点 型酶有严格的识别、切割顺序，以,基因克隆课件,识别顺序一般为,46,个碱基，通常是反转重复顺序，具有,180,的旋转对称性,也称回文结构，,palindrome,具有对称结构的,DNA,片段。一条链上的碱基顺序（例如从,5,3,）和另一条链上从,5,3,的顺序完全相同。例如，,5 GAATTC 3 3 CTTAAC 5,识别顺序一般为46个碱基，通常是反转重复顺序，具有18,RE recognition/cleavage site are palindromic DNA sequences, not palidromic as in “ABBA”.E.x.,Eco,R 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5These sites are DNA sequence that are identical on both DNA strands.,RE recognition/cleavage site a,Q: Which of the following 2 DNA sequences is a potentional RE recognition site?. 5 AGTTGA 3 . 5 GCACGTGC 3 Q: If show below is of a RE site, what is the DNA sequence for the remaining ? 5 TCA _ _ _ 3,Q: Which of the following 2 D,从理论上讲，如果,DNA,链上的,A,、,T,、,C,和,G,四种碱基随机分布，根据限制酶识别碱基的个数可估算限制酶的切割几率，同时也决定了它切割,DNA,后产生的,DNA,片段的长度。实际上，限制酶对,DNA,的切割是“全”或“无”。,从理论上讲，如果DNA链上的A、T、C和G四种碱基随,识别,4,个碱基,1/4,4,=1/256,识别,6,个碱基,1/4,6,=1/4096,识别,8,个碱基,1/4,8,=1/65536,识别4个碱基 1/44=1/256识别6个碱,5 ,型酶切割双链,DNA,产生的切口,(1),在识别顺序的对称轴上，对双链,DNA,同时切割，产生平头末端,(blunt end).,5-GGCC-3,Hae, 5-GG CC-3,3-CCGG-5 3-CC GG-5,5 型酶切割双链DNA产生的切口 (1)在识别顺序的对称轴,(2),在识别顺序的两个对称点切开,DNA,双链，产生带单链尾巴的粘性末端,(cohesive end),； 从,5,端切割产生,5,端突出的粘性末端。,(2)在识别顺序的两个对称点切开DNA双链，产生带单链尾巴的,(3),从,3,端切割产生,3,端突出的粘性末端。,(3)从3端切割产生3端突出的粘性末端。,基因克隆课件,基因克隆课件,基因克隆课件,6,限制酶使用中的注意事项,酶的活性单位：,l,小时内在,50l,容积中酶解,l g DNA,所需要的酶量。,一般都要求较纯的底物,DNA,；都需要,Mg,2,和,Tris,HCl,缓冲体系；通常在,37(,有些酶需要在,5065),反应；,6 限制酶使用中的注意事项 酶的活性单位：l小时内在50l,对离子强度的要求分为,3,个级别，即高盐,(100mmol/LNaCl),、中盐,(50mmol/LNaCl),和低盐,(0l0mmol/LNaCl),。,星号活力：限制酶在非标准反应条件下，能切割一些与其识别顺序类似的序列，降低酶切的特异性。,EcoRI 5G,AATTC3,EcoRI,*,5N,AATTN3,对离子强度的要求分为3个级别，即高盐(100mmol/LNa,在实验操作中 ，限制酶从冰箱中取出后，应立即置于冰浴中，操作时一般是将其它试剂加完后，最后加酶，操作迅速。,当反应体系中有两种限制酶时，如何处理。,在实验操作中 ，限制酶从冰箱中取出后，应立即置于冰浴中，操作,7,少数有特殊性质的,型酶,异源同工酶（,isoschizomer,）,:,是从不同生物中分离出来的酶，但有相同的识别顺序，切割,DNA,的位点可以相同，也可以不同。,5 TTT,AAA 3,3 AAA,TTT 5,Aha,或,Dra,5-TTT,3-AAA,+,AAA-3,TTT-5,5 GGTAC,C,3,3 C,CATGG,5,5 G,GTACC,3,3 CCATG,G,5,Kpn,5 GGTAC,3 C,C,3,CATGG,5,+,Asp,718,5 G,3 CCATC,+,GTACC,3,G,5,7 少数有特殊性质的型酶异源同工酶（isoschizome,同尾酶（,isocaudarner,）：为识别与切割顺序相互有关的酶。有些限制酶的识别序列包含在另一些限制酶的识别顺序中。这些酶虽来源不同，但它们能产生相同的粘性末端,。,5,G,ATC 3,3 CTAG,5,5 G,GATC,3,3 CATG,G,5,5 A,GATCT,3,3 TCTAG,A,5,Mbo,Bam,H,Bgl,同尾酶（isocaudarner）：为识别与切割顺序相互有关,远距离裂解酶（,distant cleavage,）,:,这类酶的识别位点与切割位点不一致，但其切割位点与识别位点的距离是一定的，一般为,10,个碱基左右。它们在某一核苷酸区域与识别序列结合，然后滑行到识别序列以外的另一个位点进行切割。,5NNN,GAAGA,NNNNNNNN,NNN3,E.x.,Mbo,远距离裂解酶（distant cleavage）:这类酶的识,可变酶：这类酶是,型酶中的一个特例，它们的识别序列中,1,个或几个核苷酸是可变的，并且其识别序列一般大于,6,个碱基对。,E.x. Dra, CACNNNGTG,可变酶：这类酶是型酶中的一个特例，它们的识别序列中1个或几,二、,DNA,聚合酶,功能：在体外合成,DNA,二、DNA聚合酶功能：在体外合成DNA,1,大肠杆菌,DNA,聚合酶,及其大片段（,klenow,片段）,1 大肠杆菌DNA聚合酶及其大片段（klenow片段）,大肠杆菌,DNA,聚合酶,的用途,催化,DNA,切口平移，制备高比活探针；,对,DNA,分子进行末端标记。,大肠杆菌DNA聚合酶的用途催化DNA切口平移，制备高比活探,klenow,片断的主要用途,末端终止法测序；,合成,cDNA,第二链；,双链,DNA3,端标记。,klenow片断的主要用途末端终止法测序；,2 Tag DNA,聚合酶,用途：,PCR,和测序,2 Tag DNA聚合酶用途：PCR和测序,3,反转录酶（依赖于,RNA,的,DNA,聚合酶，,RDDP,）,能以单链,RNA,或单链,DNA,为模板，按,53,方向合成,DNA,；,有,5 3,和,3 5RNA,外切酶活性（,3 5,外切活性又称,RNA,酶,H,活性）。,3 反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶，RDDP）能以单链,主要用途：,转录,mRNA,成为,cDNA,。,主要用途：转录mRNA成为cDNA。,4,末端脱氧核糖核酸转移酶,(,末端转移酶,),催化脱氧核苷酸一个个地依次加到,DNA3,末端。,功能：,4 末端脱氧核糖核酸转移酶(末端转移酶) 催化脱氧核,主要用途：,给载体或,cDNA,加上互补的多聚体尾巴，造成便于重组的人工粘性末端；,也可用于,DNA,片段,3,端标记。,主要用途：给载体或cDNA加上互补的多聚体尾巴，造成便于重组,三、,DNA,连接酶,作用：催化两个独立,DNA,片断,5,磷酸基与,3,羟基之间形成磷酸二酯键。,三、DNA连接酶作用：催化两个独立DNA片断5磷酸基与3,作用底物：,两个不同片段双链,DNA,间存在的互补粘性末端；,两个双链,DNA,分子间的平末端；,一条带切口的双链,DNA,分子；,一条带切口的,RNA/DNA,杂交体。,作用底物：两个不同片段双链DNA间存在的互补粘性末端；,四、,T4,多核苷酸激酶,作用：,催化将,ATP,的,-,磷酸转移到,DNA,链的,5,末端上。,四、T4多核苷酸激酶作用：,用途：,放射性标记,DNA,链的,5,端，用于,DNA,测序等实验中；,用于连接反应，使缺少,5,端磷酸的,DNA,片段或合成接头磷酸化。,用途：放射性标记DNA链的5端，用于DNA测序等实验中；,五、碱性磷酸酶,催化切除,DNA,、,RNA,和,dNTP,上的,5,磷酸基团。,作用：,五、碱性磷酸酶 催化切除DNA、RNA和dNTP上的5,用途：,从,DNA,片段上除去,5,磷酸以防自身连接；,在用,T4,多核苷酸激酶和,32P,标记,5,末端前，从,RNA,或,DNA,上除去,5,磷酸。,用途：从DNA片段上除去5磷酸以防自身连接；,再见,再见,67,可编辑,感谢下载,67可编辑感谢下载,