蛋白质冻融过程中的物理化学变化

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,蛋白质冻融,冻融过程到底发生了什么？,低温生物学,化学,热动力学,晶体学,冻融胁迫的产生,冻融保护,蛋白质冻融,冰晶,浓度差异,在,静置情况下融化，,往往,会看到,溶液分层情况,肉眼能观察到的冻融现象,不均匀的体系变化,融解,工艺上有不同升温速率,Slow warming 1-5,/min,：室温或自来水摇,intermediate warming,5,/min,：,37,或以上的水浴,目前常用的冻融工艺步骤,冷却,cooling,冷冻,freezing,等温,保持,温度,意义,设备,生物样品存储应用,0,-60,0,C,为组织和细胞内水的结晶温度，温度进入此范围组织内的水开始结晶伤害细胞和组织微观结构。,各种冷冻冰箱,可中长期保持经过提纯的生物大分子的稳定性，但不能存保持组织中的生物大分子稳定性、细胞活性及组织微观结构。,-80,0,C,为水的结晶温度之下较为安全的温度，同时样本内的生化反应显著减弱。也是目前自动化存储设备所能使用的最低温度。,超低温冰箱,可中期保持组织内生物大分子的稳定性；短期保持细胞活性和组织微观结构。,-136,0,C,为水的玻璃化温度，水的结晶对细胞和组织不再有明显伤害，样本内的各种生化反应几近停止。,液氮箱,/,罐气相；深冷冰箱,可中长期保持组织内生物大分子、细胞和组织微观结构的稳定性，为不少样本库推荐用于长期冻存组织。,-196,0,C,为液氮蒸发的温度，是常规方法所能实现的最低温度。样本内的各种生化反应可以认为停止，水的结晶对细胞和微观组织的伤害可以忽略。,液氮箱,/,罐液相,可长期保持组织中的生物大分子稳定性、细胞活性及组织微观结构，但对存储耗材有较高要求。,生物样品常用存储温度,一、物理胁迫,低温变性,冷冻浓缩效应,冰晶形成,二、化学胁迫,冷冻胁迫,低温变性效应,通常,发生在,0,下，,诱导蛋白质,解折叠,蛋白质的吉布斯自由能随温度变化趋势,认为跟温度下疏,水,残基的溶解度增加,变性温度与,pH,、蛋白浓度、添加剂,(,如糖、离液剂等,),有关,低盐,低温,-,lactoglobulin,chymotrypsinogen,lactate dehydrogenase,myoglobin,phosphoglycerate kinase,ribonuclease,and staphylococcal nuclease,冷冻过程中的温度变化,溶质浓度与粘度升高,溶质重新分布,溶质结晶（过饱和）,pH,变化,相分离,2.,冷冻浓缩效应,Figure 2.Temperature,%solute concentration,and viscosity profiles as a function of temperature during freezing of 3%sucrose.The data were calculated by assuming ice crystallization occurs at 15C and that the solution composition follows the equilibrium freezing point depression curve.The viscosities were estimated from a fit of viscosity data over a wide range of composition and temperature to a Vogel-Tammann-Fulcher-type equation.Data taken from Reference 7,(1),溶质浓度与粘度升高，溶质重分布,引起,反应速率发生,改变,冰,-,水界面上形成浓度梯度,(2)pH,变化,酸变碱 或碱变酸的,pH,巨大变化都是可能的,溶质结晶,一般发生在低浓度溶质中，原因,可能在于离子在冰与水之中迁移,，不同离子迁移性质与速率不同,KH2PO4,不容易析出,Na2HPO4,过饱和析出,KH,2,PO,4,-Na,2,HPO,4,-H,2,O,系统中,KCl,引起,pH,升高，,6,NaCl,引起,pH,降低，,4,Ref:Protein Stability During Freezing,，,Separation of Stresses and Mechanisms of Protein Stabilization,没食子酸,Gallic Acid,在有,NaCl,存在时冻融发生,分解,分解反应发生只在碱性溶液中，酸性环境基本不发生,提供一种思路：不添加碱性试剂的前提下，从中性或酸性环境下催化碱性反应。,共晶点：,-16.7,即使共晶点以下，,溶质扩散还在发生,没食子酸在长期保存时 浓度发生的变化,重组血红蛋白,hemoglobin,在,PEG-Dextran,系统中的相图,混合液,7%PEG,7%Dextran,顶层,10%PEG,0.2%Dextran,底层,2%PEG,20%Dextran,(3),相分离现象,诱导蛋白质结构损伤,蛋白质,分配进两种相中,，可能,使稳定剂失去保护作用,改变,稳定所需的分子间,相互作用,形成,两相界面（在不完全分离体系中，蛋白质大面积暴露）,可发生,于,电解质,-,聚合物,聚合物,-,聚合物,聚合物,-,多糖,蛋白质,-,多糖,蛋白质,-,蛋白质,蛋白质,-,表面活性剂,糖,-,蛋白质,-,多糖,电解质,-,聚合物,-,多糖,存在相分离,现象,PEG/PVP-Dextran,PVP-ficoll,PEG-,磷酸盐,3.,冰晶形成,(1),冰晶生长 冷冻浓缩,(2),冰水界面,界面有可能是疏水性的，发生吸附变性,离子迁移性质不同，产生电势,(3),结冰时，蛋白质周围的水分子有序排列，为熵增提供了热力学驱动力，产生吸附和解折叠。结冰后水分子与蛋白质分子距离发生改变，肽链发生拉扯，改变氢键、静电、范德华力及疏水作用。,(4),组织结构破坏,快的冷却速率,(,小体积到液氮,),：往往形成大量小冰晶，更多的冰水界面,化学胁迫,1.,增强,NH2,的羟胺反应,2.,共价聚合,3.,影响反应平衡,Reactions in Frozen Systems.,Journal of the American Chemical Society,冻融保护,/,低温保护,样品浓度,冷冻,降温,/,融化升温速率,3.,保护剂,2.,冻融时的温度变化速率对活性恢复的影响,3.,保护剂,举例：过氧化氢酶活性影响,低温,/,冻融 保护剂,种类：,聚合物类,PVP/PEG,在冻结过程中优先析出；具有一定的表面活性；提高溶液粘度；显著提高玻璃化转变温度；抑制溶液,pH,的降低。可以起低温保护剂和脱水保护剂作用。,多元醇 甘油,/DMSO/,乙二醇,强烈结合水分子，很强持水性，可与蛋白质形成氢键取代水，保证蛋白质稳定性。但甘油浓度提高至一定程度时，对蛋白质稳定作用能力可能达到了极限。渗入性保护剂,糖类 蔗糖,/,海藻糖,非渗入性保护剂，蔗糖在溶液中易结合水分子，发生水合作用，从而减缓晶核的生长过程，使形成的冰晶较细小，达到保护细胞的目的。,表面活性剂,改善冰晶的吸附，既能在冻结和脱水过程中降低冰,-,水界面张力所引起的冻结和脱水变性，又能在复水过程中对表面活性剂组分起到润湿剂和重褶皱剂的作用,蔗糖缩短相变过程的时间,NaCl,浓度的影响,Glycine,在磷酸缓冲液中的保护作用,显著影响磷酸缓冲液在冻融时的,pH,变化,0-50mM,降低成核速率，减少磷酸盐的结晶，,pH,会有升高,100mM,促进盐的结晶，,pH,降低,Tween-80(,聚山梨醇酯,80),的保护作用,降低冰,-,水界面的伤害,回顾,降温冷却,冰晶开始形成,冷冻浓缩效应,浓度,/,粘度升高,相分离,pH,变化,玻璃态转化温度,分子运动锁定,感谢聆听，欢迎指正！,