枸杞多糖检测方法研究

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,枸杞多糖检测方法研究,内容提要,简 介,选题背景,研究目的和意义,研究动态与趋势,拟采取的研究方法,枸杞多糖简介,来源：茄科植物枸杞的干燥果实,枸杞多糖（,Lycium,barbarum,polysaccharide,）,简称,LBP,，是,以阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半,乳糖、葡萄糖与半乳糖醛酸组成的酸性杂多糖同多肽或蛋白,质构成的复合多糖为主,还含有中性杂多糖和葡聚糖同多肽或,蛋白质构成的复合多糖，是天然的大分子物质。,Click to add text,Click to add text,Click to add text,Click to add text,Click to add text,Click to add text,Click to add text,白色略带棕色,絮状，纤维状,无味,吸湿性,理化性质（一）,性状,理化性质（二）,溶解性,1.,溶于水，二甲基亚砜，溶解度随中性单糖含量的减少而降低,2.,不溶于高浓度乙醇，乙醚，丙酮，氯仿，正丁醇等有机溶剂,理化性质（三）,常见的化学性质测定,试验 结果 结论,硫酸,苯酚反应 阳性 含中性糖,硫酸,半胱氨酸 阳性 含半乳糖醛酸,卡玛斯亮蓝反应 阳性 含有蛋白质,斐林试剂反应 阴性 不含还原糖,碘,碘化钾反应 阴性 不含有淀粉,选题背景（一）,生理活性：增强免疫、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血糖血脂、保肝，可作为,第三代功能性食品,的功能因子,随着生活水平的提高，由以治病为主向防病为主的观念转变，为功能食品的开发带来了良好机遇。功效明确的枸杞多糖符合新一代功能食品的要求，枸杞多糖的研究将推动枸杞产品向更高层次发展,保健食品的区分,第一代保健食品：以民间的处方，秘方为基础，根据原材料的功能推断保健品的功能，未经严格的科学检测的保健食品,第二代保健食品：经过动物实验和人体实验证明产品具有某项生理调节功能，其安全性，功能性都较为可靠,第三代保健食品：经过进一步的严格实验及审核，除具备第二代产品的要求外，还要明确功能能因子及其结构，含量，作用机理，类似于药品的要求,选题背景（二）,多糖一般的检测方法概括如下,:,1,将无紫外吸收的多糖与显色剂显色，产生紫外吸收，从而,用紫外法定量,如硫酸,-,苯酚法、硫酸,-,蒽酮法，,3,、,5-,二硝基,水杨酸比色法测定总糖。,2,直接测糖法，折光法测定多糖，主要是水溶性糖。原理是用,折射计测得的折射指数值,(,糖度,),代表着溶液中可溶性物质的含,量高低，若溶液中的溶质是糖物质或以糖为主的糖物质,则折射,指数值就反映着糖含量的高低。,3,多糖检测的,HPLC,法也是基于上面的思路，要么衍生化后使,用紫外或荧光检测器，要么使用通用型检测器，这类检测器,主要有示差检测器,。,蒽酮-硫酸法,多糖在浓硫酸作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糠醛或羟甲基糠醛,而生成的糠醛或羟甲基糠醛与蒽酮脱水缩合,形成糠醛的衍生物,反应后溶液呈蓝绿色 在,620nm,处有最大吸收，在,10100ug,范围内其颜色的深浅与可溶性糖质量浓度成正比 其主要反应式为,选题背景（三）,质量不易控制,枸杞多糖是一个水溶性的大分子物质,不能如小分子物质那样,通过熔点测定、元素分析,四大光谱等鉴定后,制定质量标准。,分子量测定,决定了枸杞多糖的生物活性，分子量过大不易透过细胞膜，影响活性，分子量小一般是没有活性的，因此分子量数据可以作为枸杞多糖质量标准的重要指标。,多糖的单糖组成分析,是进行多糖质量控制和获取多糖基本信息的重要环节。单糖组分及其摩尔比可以作为质量标准的重要指标。,分子量测定,高分子物质的分子量测定有渗透压法、蒸气压法,凝胶色谱法、超速离心法等，但已有的报导大多集中在有机溶剂体系的高分子聚合物如各种塑料产品、人工橡胶等，水体系大分子物质如蛋白质、多糖的分子量测定很少报导,单糖组成测定,方法主要有,TLC,、,GC,、,HPLC,、,CE,等,但是关于枸杞多糖柱前衍生化高效液相色谱法测单糖组成还未见报道。,研究目的,建立一个枸杞多糖的质量标准,定量鉴别方法,：,(1),通过,HPLC,法测定枸杞多糖的分子量,(2),通过柱前衍生化高效液相色谱法测定枸杞多糖的单糖组成及其摩尔比,在多糖的分子量测定方法、尤其是枸杞多糖的测定方法尚未确立标准，无据可依的情况下，继承传统保健理论的同时结合现代科学检测技术，找出枸杞多糖的最优检测方法，制订枸杞多糖的检测标准，为以后的枸杞多糖检测提炼提供依据。,研究意义,研究动态,常见的,检测方法,化学方法,物理方法,苯酚,-,硫酸法，高碘酸氧化，,Smith,降解，甲基化分析,比旋光仪、紫外分光光度计、,红外光谱仪、液相色谱仪、,气相色谱仪、质谱、核磁共振,从所得到的数据来看，国内对枸杞多糖的分离纯化，,含量测定分离提取、,分级纯化组分鉴定,及其分子量、结构、基本性质等方面有大量成果报道,但,研究者所得出的枸杞多糖,分子量、,组成,、,结构、等研究结果各不相同,枸杞多糖相对分子量的检测方法,蒸汽压法,凝胶过滤法,HPLC,渗透压法,光散射法,粘度法,a,f,e,b,c,d,分子量的测定方法,凝胶过滤法,将已知分子量的葡聚糖标准品进行凝胶层系，洗脱收集，用硫酸,-,蒽酮法检测多糖，分别求得相应的洗脱体积,Ve,用蓝色葡聚糖上柱求得外水体积,Vo.,以,Ve,/Vo,为纵坐标，,lgMr,为横坐标，得到分子量的标准曲线。,3.,取枸杞多糖进行一样的操作求得,Ve,/Vo,查标准曲线可求得多糖的分子量,相对,分子量,LBP-,，,LBP-,，,LBP-,，,LBP,相对分子量均大于,20000,1,LBPA,3,LBPB,1,LBPC,2,，,LBPC,4,分子量分别,为,66000,，,18000,，,12000,，,10000,2,Duan 分离得到了4 个均一枸杞多糖,其,分子量在82115 kDa 之间,3,黄等分离得到三类,LbGP,，其分子量分别为,925000,，,2148000,，,237000,4,王建华通过,SDS-,不连续体系凝胶电泳法,测得,LBP2a,分子量为,77482,5,多糖中单糖的组成及其摩尔比的测定方法,对微量物质的检出体现了高分辨率的特点，但是所测样品具有一定的挥发性，衍生化操作烦杂、费时,GC,分离速度快，分离效果好，重现性好，不破坏样品，前处理简单,HPLC,操作方便，灵活但是灵敏度不高，对含量微小的物质不易检出，且无法确定单糖摩尔比,TLC,组成成分,单糖：,阿拉伯糖，鼠李糖，木糖，甘露糖，半乳糖，葡萄糖,半乳糖醛酸,-,硫酸,-,半胱氨酸反应定性,蛋白质,-,斐林,-,酚法,枸杞多糖中单糖的组成及其摩尔比,名称,单糖组成,摩尔比,LBP-6,Ara,：,Rha,：,Xyl,：,Man,：,Gal,：,Glc,4.83:0.17,：,0.23,：,019:1:1,LBP-,Ara,：,Rha,：,Xyl,：,Man,：,Gal,：,Glc,1:3.15:0.48:0.84:5.17:4.13,LBP-,Ara,：,Rha,：,Xyl,：,Man,：,Gal,：,Glc,1:3.57:0.02:0.22:1.53:1.03,LBP-,Ara,：,Rha,：,Xyl,：,Man,：,Gal,：,Glc,2.43:4.22:0.95:0.38:0.38:1,LBP-,Ara,：,Rha,：,Xyl,：,Man,：,Gal,：,Glc,2.53:3.57:1.33:0.29:1:0.86,蛋白多糖,G,Ara,：,Rha,：,Xyl,：,Man,：,Gal,：,Glc,2.8:0.2:0.08:0.2:2.6:1.0,LBP-V,Ara,：,Gal,：,Glc,2.5:1.0:10,LBNP,Ara,：,Xyl,：,Man,：,Gal,：,Glc,1.0,：,10.0,：,1.0:6.7:4.0,LBPC,2,Xyl,：,Rha,：,Man,8.8,：,2.3,：,1,LBPC,4,Glc,红外光谱法,方法：,KBr,压片法 波长范围：,4000650cm,-1,目的：主要是确定吡喃糖的苷键构型及常规观察其他官能团。,枸杞多糖常见官能团红外光谱解析,紫外检测,在,200nm,处有多糖,的特征吸收峰,在,260nm,处没有吸收峰，,说明不含核酸,在,280nm,处吸收峰不明显，,说明蛋白质含量低,发展趋势,1),枸杞多糖结构与活性、功能的关系方面得到明确，市场上将有更多以枸杞多糖为主要成分的新药，并且都是采用现代生物技术，从分子、细胞、器官等分子生物水平上研究活性因子的结构、含量及其作用机理，准确评价其功效。,2,）因为有统一的质量标准，明确的结构证明其新颖性，创新性，实用性，中国除了主要围绕枸杞多糖的提取方法、纯化工艺、分离技术、制备治疗脂肪肝胃溃疡药物应用等专利以外，还将得到更多关于枸杞多糖的组分结构、作用机制、药理功效等方面的专利。,拟采取的研究方法及可行性分析,(1),通过,HPLC,法测定枸杞多糖的分子量,可行性分析：严邦干曾采用此法测定香菇多糖的分子量，该方法较其他多糖测定法具有迅速，简便，准确的特点，是目前较为行之有效的测定方法,.,(2),通过柱前衍生化高效液相色谱法测定枸杞多糖的单糖组成及其摩尔比,可行性分析：采用,3-,甲基,-1-,苯基,-2-,吡唑啉酮,(PMP),在碱性条件下与单糖定量缩合生成单糖,PMP,衍生物,用常规的紫外检测器和,C,18,烷基键合柱,建立适于多糖单糖组成测定的,HPLC,新方法,达到灵敏、快速、准确、方便和可在线大批量分析的目标。,HPLC,法测分子量,色谱柱：,protein kw-804,检测器：示差折光检测器,温度：室温,流动相：醋酸钠缓冲溶液,以不同分子质量的标准右旋糖酐分子的分离保留时间与相应的分子质量建立分子质量对数值绘制标准坐标曲线，待测得枸杞多糖经分离后得到不同分子质量峰的保留时间值，通过标准曲线即可计算枸杞多糖的分子质量分布（由分子质量计算辅助软件自行运行）,HPLC,检测单糖组分和含量,直接进样检测：,柱子：,carbohydrate,柱,氨基键合相柱（,Spherisorb NH,2,，,Hypersil NH,2,）,检测器：示差检测器,缺点：柱子成本高，氨基键合柱易与还原糖生成希夫碱，缩短柱子的寿命,示差检测器灵敏度低，不适用于梯度洗脱,柱前衍生化HPLC测枸杞多糖中的单糖组成,前处理：,1.,样品水解：,a.,硫酸适合于中性糖的水解,b.,三氟醋酸适用于植物细胞壁多糖，糖蛋白，糖胺聚糖的水解,（,1,）多糖的水解常用硫酸，其用量不易控制，过多会导致多糖样品的炭化，而产生杂质峰，过少又会水解不完全。本法采用三氟醋酸可较好的实现多糖的水解。,（,2,）实验中要尽量减少样品的水分含量，以免影响衍生化的结果，在衍生化时，适当加大无水醋酸酐的用量也可减小水分的影响。,柱前衍生化,1.,糖类衍生的试剂：,2-,氨基苯甲酸、对甲氧基苯胺、,2-,氨基吡啶、,6-,氨基喹啉、对硝基苯甲酰氯 和,3-,甲基,-1-,苯基,-2-,吡唑啉酮,(PMP),2.,步骤：,a.,对照品各种单糖标准品,Ara,，,Rha,，,Xyl,，,Man,，,Gal,，,Glc,，,Fuc,按等量混合,衍生化,b.,枸杞多糖水解液衍生化,柱前衍生化反应,PMP,的优点：,PMP,与糖类物质衍生时反应条件温和,产物无立体异构。两分子,PMP,与一分子单糖缩合，生成的衍生物与各单糖的定量关系明确，线性关系良好。检测灵敏度较高,可同时检测醛糖、酮糖及糖醛酸,PMP,衍生物在,250 nm,处有强烈的紫外吸收，克服了单糖本身没有紫外吸收的特点，同时使用紫外检测器克服了示差检测器灵敏度低，不适用于梯度洗脱的缺点。,HPLC,色谱条件,色谱柱：,C,18,色谱柱,检测器：紫外检测器,检测波长：,250nm,柱温：室温,进样量：,20ul,流动相,(,流速：,1.2ml/mi