酶的提取纯化与活力测定(精)课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五节,酶的提取纯化与活力测定,一.酶的分离与提取,酶提取基本的方法,细胞产生的酶有二类：,1.由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶，称为,细胞外酶,。这类酶大部分属于水解酶。此类酶通常含量高，容易得到。,2.在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为,细胞内酶，,该类酶在细胞内往往与细胞器结合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序性。,A.,了解所分离酶在细胞中分布,B.,材料的获取,在提取某一酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料限制，成本又很大，因此，目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。,一.酶的分离与提取,酶提取基本的方法,C.,酶分离纯化的主要步骤,1.,主要步骤为：抽提、纯化、结晶,抽提：,破碎细胞，动植物组织一般可用组织捣碎器；或者加石英砂研磨，将材料做成丙酮粉或进行冰冻融解；对细菌，常采用加砂或加氧化铝研磨和超声波振荡方法破碎。,大多数酶一般都用缓冲液进行抽提，缓冲液的类型决定于酶的种类和理化特性，抽提液,pH,最好远离等电点。,一.酶的分离与提取,酶提取基本的方法,C.,酶分离纯化的主要步骤,1.,主要步骤：抽提、纯化、结晶,浓缩：,抽提液或发酵液中酶浓度往往很低，必须浓缩富集。常用的浓缩方法有：加中性盐或冷乙醇沉淀后再溶解，胶过滤浓缩以及超过滤浓缩法等。,纯化：,纯化过程就是去除杂质的过程。原则：一方面是要提高酶的纯度，另一方面却也使酶的总量不可避免有所损失。,一.酶的分离与提取,酶提取基本的方法,C.,酶分离纯化的主要步骤,1.,主要步骤为：抽提、纯化、结晶,结晶：,浓缩液经过各种方法的纯化，可得到较纯的结晶产品,。,一.酶的分离与提取,酶提取基本的方法,C.,酶分离纯化的主要步骤,2.选择分离纯化方法,a.,盐析法（如硫酸胺）,b.,有机溶剂沉淀法,c.,层析纯化法（葡聚糖凝胶、阴离子交换层析）,d.,等电点法,e.,吸附分离法,一.酶的分离与提取,酶提取基本的方法,1.酶活力概念,酶活力,是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催化的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。,二.酶活力及其测定,但是，酶的定量并非对其蛋白质进行定量，而是对它的,催化能力,进行定量。,所以，酶的定量就是测定酶的活力，也即测定酶促反应的速度。,二.酶活力及其测定,1.酶活力概念,如何测定酶活力？,以,产物浓度,对,反应时间,作图，可得到,酶促反应速度曲线,0,产物浓度,时间,注意：初速度的测定是关键，为什么？,二.酶活力及其测定,1.酶活力概念,可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着时间的延长，反应速度逐渐下降,产物浓度,时间,0,原 因,底物浓度的降低、产物的增加造成的逆反应的加快,产物的抑制作用,酶本身逐渐失活,二.酶活力及其测定,1.酶活力概念,常用的酶活力单位有三种：,A.,国际单位(,IU),这种单位是由国际酶学委员会规定的。,在,标准条件,(25、最适,pH、,最适底物浓度)下，酶,每分钟,催化,1,m,mol,底物转化，这样的速度所代表的酶的活力即酶的量定义为,1个国际单位(,IU),。,2.酶活力与单位,二.酶活力及其测定,B.Katal,是由国际酶学委员会于1972年规定的一种新单位,在,最适条件,下，酶,每秒钟,催化,1,mol,底物转化，这样的速度所代表的酶的活力即酶的量定义为,1个,Kat,。,1 Kat=6010,6,IU,2.酶活力与单位,2.酶活力与单位,二.酶活力及其测定,C.,自定义的活力单位,这种单位简单方便，省去了许多计算；但只能进行酶活力的相对比较。,酶习惯上或测定时使用的,反应速度的单位,定义为酶的活力单位。,有的甚至直接用测得的物理量，如单位时间内消光值的变化(,D,A/t),表示酶活力单位。,2.酶活力与单位,2.酶活力与单位,二.酶活力及其测定,指,每毫克,酶蛋白所含的,酶活力单位数,比活力是酶制剂纯度的常用指标,比活力越大，表示酶越纯,比活力 ,酶活力单位数（,U）,酶蛋白质量（,mg）,3.酶的比活力,二.酶活力及其测定,纯化倍数,=,每次比活力,/,第一次比活力,产率(回收率),=,每次总活力,/,第一次总活力,100%,4.酶的纯度,二.酶活力及其测定,1.某酶在一定条件下，5,min,内使30,mmol,底物转变为产物，问该酶的活力（,IU）,是多少？,2.从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300,mL,含有150,mg,蛋白质，总活力为360单位。经过一系列纯化以后得到的4,mL,酶制品(含有0.08,mg,蛋白)，总活力为288单位。请问回收率是多少？纯化了多少倍？,4.酶的纯度,二.酶活力及其测定,不同样品同一酸制剂的总活力、总蛋白、比活力比较,4.酶的纯度,二.,酶活力及其测定,纯化,进程,甲,乙,丙,丁,总活力,6,4,3,2,总蛋白,(,mg),20,10,5,2,比活力,(,U/mg),6/20,4/10,3/5,2/2,