酶活性的测定

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,过氧化物酶,(,),活性的测定,愈创木酚法,一、实验原理,过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物。,实验以愈创木酚为过氧化物酶的底物。在此酶存在下，,H,2,O,2,将愈创木酚氧化生成茶褐色产物。此产物在,470nm,有最大光吸收，故可通过,470nm,处的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。,二、材料和设备,、材料：马铃薯块茎,、仪器设备：,751,型分光光度计、离心机、研钵、,25ml,容量瓶、量筒、试管、吸量管。,、试剂：,0.05ml/L,愈创木酚溶液，,0.05ml/L,的磷酸缓冲液,(pH5.5),，,2%H,2,O,2,，,0.1mol/L,儿茶酚溶液，,20%,三氯乙酸溶液,三、实验步骤,、酶液的制备,取,5.0g,洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中。加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于,3000g,水中离心,10min,，上清液转入,25ml,容量瓶中。沉淀用,5ml,磷酸缓冲液再提取次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。,、过氧化物酶活性的测定,酶活性测定的反应体系包括,:2.9ml 0.05mol/L,磷酸缓冲液、,1.0ml 2%H,2,O,2,、,1.0ml 0.05mol/L,愈创木酚和,0.1ml,酶液。,以在沸水中加热,5min,的酶液为对照，做二组重复实验。反应体系加入酶液后，立即于,37,水浴中保温,15min,，然后迅速转入冰浴中，并加入,2.0ml 20%,三氯乙酸终止反应。然后，过滤,(,或,5000g,离心,10min),滤液适当稀释，用,751,型分光光度计在,470nm,波长下测定反应体系的吸光度。,四、实验结果,以每,min,内,A,470,变化,0.01,为,1,个过氧化物酶活力单位,酶活力,=,D,酶的比活力,=,D,式中，,A,为反应时间内吸光度的变化；,W,为马铃薯鲜重（,g,）；,t,为反应时间（,min,）；,D,为稀释倍数，即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数,A,0.01t,A,0.01Wt,CAT,过氧化氢酶活性测定方法,过氧化氢酶,(Hydrogen Peroxidase),又名触酶,(Catalase,，,CAT),，是一类以铁卟琳为辅基的结合酶，由,4,个亚基组成，分子量为,240 000,。存在于动植物组织与细胞中的氧化还原酶类，它专一性地将细胞代谢产生的过氧化氢分解成,H,2,O,和,0,2,，避免了,H,2,0,2,在体内积累，从而可维持体内正常的活性氧水平。是最早发现的与种子活力有关的氧化酶类之一,.,过氧化氢酶的应用：,被,用于食品包装，防止食物被氧化,。,在纺织工业中,，被,用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含过氧化物的,。,它还被用,在,隐形眼镜,的,清洁上：眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡后，使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化,氢。,近年来，过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了该酶和过氧化氢，目的是增,加,表皮,上,层的细胞氧量,。,植,物细胞中的过氧化物酶体参与,了,光呼吸,（,利用氧气并生,成,二氧化碳,）,和共生性氮固定（,将,氮气,(,N2,）解离为活性氮原子,）。,细胞,被,病原体,感,染时，过氧化氢可以被用作一种有效的,抗,微生物,试剂。,其活,性也与粮食品,质之,间有一定的相关性，是一项衡量谷物品质的重,要,指,标。,过氧化氢酶的测定：,化学测定法：高锰酸钾滴定法，碘量法。,光度法：紫外分光光度法，荧光分析法，化学发光法。,电化学法：极谱氧电极法，电流测定法，电泳一染色法。,放射化学测定法。,简易气量测定法。,高锰酸钾滴定,法,：,过,氧化氢酶（,CAT,）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂,。,据,此，可根据,H,2,O,2,的消耗量或,O,2,的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的,H,2,O,2,溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的,H,2,O,2,。,即,可求出消耗的,H,2,O,2,的量,。,酶活性用每克鲜重样品,1min,内分解,H,2,O,2,的毫克数表示：,酶活,(mgH,2,O,2,/gFW,min)=,式中,A,对照,KMnO,4,滴定毫升数；,B,酶反应后,KMnO,4,滴定毫升数；,V,T,酶液总量（,ml,）；,V,1,反应所用酶液量（,ml,）,;,W,样品鲜重（,g,）；,1.7,1ml 0.1mol/L,的,KMnO,4,相当于,1.7mg H,2,O,2,。,紫外分光光度法,:,H,2,O,2,在,240nm,波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧,化氢，使,反应溶液吸光度,(A,240,),随反应时间而降低。根据,测量,吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性,。,以,1min,内,A,240,减少,0.1,的酶量为,1,个酶活单位（,u,）。,过氧化氢酶活性,(u/gFW/min)=,式中,A,240,=A,S0,A,S0,加入煮死酶液的对照管吸光值；,A,S1,A,S2,样品管吸光值；,Vt,粗酶提取液总体积（,ml,）；,V,1,测定用粗酶液体积（,ml,）；,FW,样品鲜重（,g,）；,0.1,A,240,每下降,0.1,为,1,个酶活单位（,u,）；,t,加过氧化氢到最后一次读数时间（,min,）。,方法比较：,研究认为，化学滴定法重复性差、紧密度低、操作繁琐、检测线低，不适于大批量的样品测定。其优点是不需要任何特殊的仪器，适用性比较广泛。,紫外分光光度法具有重现性好，操作简单、快速、检测线相对较低得到优点。但是对于测定底物或产物改变量方面不太准确。,总结：,综上所述，过氧化氢酶活性测定的方法大都基于过氧化氢酶催化过氧化氢的分解反应：根据反应生成的氧气的量、反应剩余的过氧化氢的量或根据反应时的电子的转移及电流的变化等。同时，影响测定结果的因素很多，如过氧化氢的浓度、酸度、温度及重金属的含量等；并且各种方法的准确性和灵敏度也有一定差异。因此，在测定,CAT,活性时，应该根据具体组织种类及测量要求选择适合的测定的方法。,抗坏血酸过氧化物酶（,APX,）活性测定,在茶叶中,实验原理,APX,（抗坏血酸过氧化物酶）催化,AsA,与,H,2,O,2,反应而使,H,2,O,2,:2AsA+H,2,O,2,2MD-AsA(,单脱氢抗坏血酸,)+2H,2,O,。抗坏血酸过氧化物酶是以抗坏血酸为电子供体的，,APX,首先与,H,2,O,2,形成中间复合物，中间复合物接着氧化,AsA,形成产物，当,AsA,未被复合物利用时，,APX,失活。只要,AsA,能够再生，,APX,就能充分进行催化反应，从而保护叶绿体维持正常的光合能力。,APX,酶液的制备,称取,0.5g,的茶树鲜叶剪碎，加入适量的石英砂、,PVPP,和,7.5mL,酶提取液，在冰浴中充分研磨，离心（,10000g,、,4,、,20min,）取上层清夜,1mL,，分装于小离心管中置于,4,备用或,-20,保存。,APX,活性的测定,提取液：,50mmol/LPBS,（磷酸氢二钾,-,磷酸二氢钾缓冲液），,pH7.8,；,2mmol/L AsA,；,5mmol/L EDTA,。,反应液：,50mmol/LPBS,，,pH7.0,；,0.5mmol/L AsA,；,0.1 mmol/L EDTA,。,在三个比色皿中各加入,20L,鲜叶,APX,粗酶液，再加入,3mL,反应液；,1,号比色皿中不加,AsA,和,H,2,O,2,启动反应；每,10s,连续记录室温下,290nm,吸光值的变化,X,。室温下每一分钟氧化,1molAsA,的酶量作为一个酶活性单位（,U,）。,计算公式,每克鲜叶,APX,的酶活性,U=,（,X,7.5,1000,60,1000,）,/,（,m,2.8,20,10,）,上式中，,X,：,OD,值的变化；,7.5,：每克材料提取,7.5mL,粗酶液；,1000,：将,ml,转化成,L,；,60,：将,1min,转化成,60s,；,1000,：将,mmol,转化成,mol,；,m,：鲜叶的重量，单位为,g,；,2.8,：吸光系数,mmol/L cm,；,20,：用,20,L,酶液进行活性测定；,10,：每,10s,记录吸光值的变化。,测定茶树鲜叶,APX,活性的最佳条件,PVPP,的加入量为鲜叶重的,1.5,倍，提取液,pH,为,7.8,，反应液,pH,为,7.0,，底物,AsA,浓度为,0.5mmol/L,。,注意事项：,（,1,）由于测定反应是通过测定反应底物,AsA,的降低来计算,APX,活性，因此所加的酶量一般不宜过大，应使加液量控制在,60s,内，使产生的,A,290,光值下降呈良好的线性关系。,（,2,）由于此反应中,AsA,和,H,2,O,2,量都很少，可以将,30%,的,H,2,O,2,稀释,500,倍，在测定时直接吸取,15,L,的,H,2,O,2,与,3mL,反应液将加入到比色皿中，启动反应。,（,3,）,H,2,O,2,由于本身对,AsA,的氧化作用在测定时间内可以忽略不计。,超氧化物歧化酶（SOD）,的,活性测定,黄嘌呤氧化酶法,原理,:,通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基（O,2,-），后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。,实验试剂：,硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌呤氧化酶，醋酸等。,实验步骤：,计算方法：,每毫升反应液中SOD 抑止率达50时对应的SOD 量为一个SOD 活力单位（U），待测样品中的SOD 活力由下式计算：,SOD抑制率（）（A2-A1）/A2,100%,SOD 活力（U/ml）（A2-A1）/A2,100%,50,反应体系的稀释倍数,样本测试前的稀释倍数,式中：A1:测定管的吸光值；A2:空白管的吸光值。,邻苯三酚自氧化法,原理：,在碱性条件下,邻苯三酚迅速氧化释放出超氧化物阴离子，生成有色中间产物，吸光度随之增加，使吸光度值与反应时间呈良好的线性关系。SOD 加入邻苯三酚自氧化反应体系后，催化超氧化物阴离子生成过氧化氢，使有色中间产物的生成受阻，导致吸光值下降，邻苯三酚自氧化速率降低，可作为测定 SOD 活性的理论依据。,1.试剂,：,0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH8.2内含 2mmol/L EDTA)0.2mol/L,（,Tris,）,三羟甲基氨基甲烷(内含 4mmol/L 乙二胺四乙,酸EDTA,)100