土壤线虫卵检查方法

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,土壤线虫卵检查方法,江西省寄生虫病防治研究所,漂浮法原理,先用碱性溶液和已经处理过的土壤样品充分混合，用比重比虫卵重的溶液把虫卵漂浮到液体表面，从而收集进行镜检。,几种漂浮液和蠕虫卵比重,饱和硝酸钠溶液,1.358-1.365,饱和硫酸锌溶液 1.180,饱和盐水 1.175-1.200,华支睾吸虫卵 1.170-1.190 姜片吸虫卵 1.190,日本血吸虫卵 1.200 钩虫卵 1.055-1.080,鞭虫卵 1.150 蛲虫卵 1.105-1.115,受精蛔虫卵 1.110-1.130,未受精蛔虫卵 1.210-1.230,采样与处理,1、菜田 取从土表及表层以下2 cm处泥土；,2、厕所、庭院、厨房取表层土；（无土层或土量不够，以鞋底刮取的土样替代）,3、每份粪样50-100 g；,4、土样取回后自然晾干；,5、晾干土样挑去粗大杂物，压碎土样大颗粒；,6、收集孔径3 mm粗筛后2 mm过筛土样。,方法,1、取土样5g于15 ml离心管，加5%NaOH溶液至10-14 ml刻度；,2、颠倒充分混匀（重复34次，每隔10 min），2000 rpm，4min；,3、倾去上部的NaOH，加入饱和NaNO,3,搅拌混匀，2000 rpm，4min；,4、离心后，再加饱和NaNO,3,满至管口，覆上18mm18 mm盖玻片；,5、静置15 min后，取下盖玻片置载玻片上镜检（每样做两管，取平均值为计数结果）；,6、一份样品计数34张盖玻片。,孔径2mm,孔径3mm,过筛土样,5%的NaOH溶液,5%的NaOH溶液,离心后土样,取5g土样于15ml离心管内，加5%NaON溶液,振摇混匀，2000转离心4min,饱和硝酸钠溶液,离心后土样,弃NaOH溶液，加饱和硝酸钠溶液混匀，2000转离心4min,静置15min取下镜检,饱和硝酸钠溶液,沉淀土样,再加饱和硝酸钠溶液满至管口，覆上盖玻片,土 壤,土壤线虫卵生活力测定法,在土壤线虫卵生活力测定法中，可选用直接镜检法，染色法和培养法，以直接镜检为常用。,土壤蛔虫卵直接镜检法：,是根据蛔虫卵在发育过程中所出现的各种形态，以鉴别其死活。,鉴别受精卵和未受精卵；,鉴别有生活力和失去生活力(变性卵)的受精卵和含有幼虫卵的形态。,土壤蛔虫卵生活力鉴别要点,未受精蛔虫卵形态,多为长椭圆形，有时呈不规则形，大小平均为80984060 m，一般为黄褐色，有时蛋白质壳发育不全，有时完全失去蛋白质壳，卵内经常充满大大小小油滴状的卵黄细胞。,未脱蛋白膜和脱蛋白膜未受精蛔虫卵,受精蛔虫卵形态,活受精蛔虫卵,蛋白质壳为黄褐色，脱蛋白质壳的为无色透明；平均大小为50704050 m；外层卵壳厚，内层薄，有屈光性，最外层蛋白质壳也很厚，呈乳状或花纹状突起；卵内有一个球形的卵细胞，卵壳两端和卵细胞之间，有,半月形,空隙，卵内卵黄颗粒清晰而致密。,含有活幼虫卵,虫体的前后部没有颗粒，中部颗粒清晰而有金属光泽，有立体感，镜检时，注视或轻压，可见有轻微蠕动，强压后，有时可挤出幼虫。,活受精蛔虫卵形态,未脱蛋白膜,脱蛋白膜,含4个卵细胞,（脱蛋白膜）,桑椹期,（脱蛋白膜）,含幼虫的活,受精蛔虫卵,死受精蛔虫卵(变性卵),卵细胞移向一端，使卵壳两端呈现有,大小不等的半月形空隙,；,卵内脂肪变性，,形成空泡，,很像未受精卵；,卵细胞质浑浊，,呈黑色或棕黑色,；,卵细胞向不定部位呈球状收缩；,卵壳的一侧或两侧，一端或两端向内凹陷或破裂；,卵细胞颗粒减少或消失;只有蛋白质壳，而缺内容物。,含死幼虫虫卵,幼虫体内几乎,充满颗粒,，且模糊不清，无金属光泽，缺乏立体 感，镜检时久久不见蠕动，稍稍加热或轻压，不会蠕动；强压时，虽能挤出幼虫，但也不改变其原来的卷曲状态。,死受精蛔虫卵形态,未脱蛋白膜,脂肪变性,胞质空泡,脱蛋白膜,含幼虫死卵,卵细胞崩解,卵细胞皱缩,上部形成空泡,卵细胞不规则裂开,卵胚变形,卵壳内幼虫变形,活受精蛔虫卵,卵细胞崩解的死受精蛔虫卵,空泡化死受精蛔虫卵,含幼虫的活受精蛔虫卵,含幼虫的的活受精蛔虫卵,卵壳内幼虫变形的死受精蛔虫卵,内含物变形死受精蛔虫卵,活鞭虫卵,含幼虫的活鞭虫卵,鞭虫卵（细胞质形成空泡）,螨 卵,螨卵,美蓝、伊红、硼砂染色法鉴别蛔虫卵死活,1,、美蓝、伊红、硼砂染液（简称M.E.B）的配制,将0.2 g美蓝加入100 ml蒸馏水中煮沸10 min，加入硼砂0.5g，再煮沸10 min，冷却后加入伊红0.1g，待完全溶解后过滤备用。（pH为1011，在室温中可放置1.5年）。,2,、脱蛋白膜,将收集的蛔虫卵加入30%次氯酸钠，作用1 min，并经常振荡，再用蒸馏水洗 2 次，即可脱掉蛋白膜。,3,、染色镜检,虫卵沉淀物加M.E.B染色液各一滴于载玻片上，上覆,盖玻片，静置35 min后镜检。,吸取虫卵沉淀物1滴放入小试管内，加入染色液染30,分钟，再用蒸馏水洗23次，吸取沉淀物镜检。,（活虫卵卵壳、内含物不着色，死虫卵卵壳、内含物染成蓝色）,土壤钩虫卵的检查,虫卵及幼虫在体外的发育,条件 温暖(25,o,C30,o,C)、,湿度(60%80%)、,荫蔽、氧足的疏松泥土,发育快（58天）,虫卵,24h脱壳,杆状蚴,以细菌及其分,解有机物为食,58天蜕皮两次,丝状蚴,感染期,1、取表层 23 cm土样，在 500 ml塑料烧杯中定量至 300 ml刻度（约 300 g表层土）后放入保鲜袋，注明土样编号，在记录本注明取样点、种植物类型、户主姓名、采样份数等基本信息。,2、分样筛（20目，直径 20 cm）筛网面上铺上2层棉纸（棉纸直径 28 cm），随后倒入样本土，用大镊子将颗粒较大的土块压细后将土铺展均匀。,土壤钩蚴分离方法,3、将铺好的分样筛放入搪瓷盘（或不锈钢脸盆）中，加入45的自来水，至水的液面稍没过筛网面的棉纸为止。,4、将搪瓷盘（或不锈钢脸盆）放入水浴箱（或温箱）中，水温控制在 45左右，放置1.5小时。,5、取出分样筛，将搪瓷盘（或不锈钢脸盆）中的水倒入三角量杯（烧杯）中进行自然沉淀半小时。,6、缓缓弃去上清，留底部 50 ml或更少的液体，于平皿中解剖镜镜检，进行十二指肠钩虫和美洲钩虫钩蚴的鉴别和计数。,钩蚴分离注意事项,1、土样应在早上10点前采集完毕；,2.、采集的土样在近一段时间内没有喷过杀虫剂；,3、若分离后水太浑浊，可进行水洗和半小时沉淀的步骤，重复多次。,两种钩虫丝状蚴的鉴别要点,鉴别要点,美洲钩虫,十二指肠钩虫,外形,长纺锤形，虫体较短粗，头端略圆，,尾端较尖,，体长0.56 mm,圆柱形，虫体细长，头端略扁平，,尾端较钝,，体长0.66 mm,鞘横纹,显著(高倍镜下),不显著(高倍镜下),食管矛,黑色杆状,，前端稍分叉，两矛粗细相等，两矛间距窄(低倍镜下),透明丝状，背矛较粗，两矛间距宽(低倍镜下),肠管,管腔较宽，为体宽的3/5，肠细胞颗粒少,管腔较窄，为体宽的1/2，肠细胞颗粒丰富,美洲钩虫,钩虫丝状蚴的鉴别,十二指肠钩虫,食管矛,美洲钩虫,十二指肠钩虫,鞘膜横纹,钩蚴、粪类圆线虫、东方毛圆线虫鉴别：,钩虫丝状蚴的咽管长度约为体长的1/5，,尾端尖细,；,粪类圆线虫丝状蚴咽管长度约为体长的1/2，,尾端分,叉,，无球形膨大；,东方毛圆线虫丝状蚴咽管长度约为体长的1/4，,尾端,有小球膨大,。,谢 谢！,