2015毛细管电泳课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,第一节 概述,电泳Electrophoresis)是指溶液中带电粒子在电场的作用下向与自身带相反电荷的电极移动的现象。将电泳进展成为分别技术应归功于Tiselius(瑞典,蒂塞利乌斯)的工作。他于1937年建立“移界电泳moving boundary electrophoresis)”，成功地将人血清中的蛋白质分为白蛋白、和球蛋白，这项工作成为蛋白质化学进展的根底，因此Tiselius本人荣获1948年诺贝尔化学奖。,第,15,章 毛细管电泳法,电泳 C槽和电极 V1、V2,2,经典电泳法散热差，分别电压受到限制。,1981年，Jorgenson和Lukacs发表了在毛细管电泳进展史上具有划时代意义的工作，他们承受75m内径的石英毛细管做为分别室，紫外柱上检测的方法，在30kv的分别电压下分别丹酰化氨基酸，柱效到达40万个理论塔板。他们的工作为毛细管电泳的进展奠定了根底。,James W.Jorgenson,North Illinois University,化学系教授,3,其次节 根本原理,电泳electrophoresis是指溶液中带电粒子离子在电场中定,向移动的现象。,电泳淌度：单位电场强度下，带点粒子的电泳速率。,式中 电泳迁移率电泳淌度，为电泳速率,一、电泳和,电泳淌度,电泳淌度与带电粒子半径r及电荷q间的关系,电泳淌度的差异构成了电泳分别的根底,4,二、电渗和电渗淌度,电渗electroosmosis)是毛细管电泳分别理论中最根本的概念之一。,5,电渗,是指在电场作用下，毛细管中或固相多孔物质内，电解,质溶液朝一个方向迁移的现象。电渗速率 与固液两相界面,的双电层,Zeta,电位 ，缓冲溶液的介电常数 和黏度 有关，,与电场强度成正比。,单位场强下的电渗速率，称为,电渗淌度,6,三、表观淌度和迁移时间,表观淌度,表观迁移速度,正离子,ep,+,eo,u,ep,+u,eo,中性分子,eo,u,eo,负离子,eo,-,ep,u,eo,-u,ep,由于电渗流速度大大高于电泳速度，所以，不管正离子、负离子还是中性分子，均随电渗流移动。,7,1)CE,中电渗流的流形,电荷均匀分布，整体移动,电渗流的流淌为平流,塞式流淌谱带展宽很小；,高效液相色谱中的溶液流淌为层流,抛物线流型,管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍引起谱带展宽较大。,四、柱效和分别度,8,2 CE中电渗流的作用,电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的57倍；,各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：,阳离子运动方向与电渗流全都；,阴离子运动方向与电渗流相反；,中性粒子运动方向与电渗流全都；,1可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分别；,2转变电渗流的大小和方向可转变分别效率和选择性，犹如转变LC中的流速；,3电渗流的微小变化影响结果的重现性；,在CE中，把握电渗流特殊重要。,9,3)无涡流集中项与传质阻力项,在HPCE中，仅存在纵向集中，H=B/u,集中系数小的溶质比集中系数大的分别效率高，分别生物大分子的依据。,影响分别度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分别度可按谱图直接由下式计算：,为两组分电泳淌度的差值,10,第三节 毛细管电泳仪和试验操作,一、毛细管电泳仪,11,1.,高压电极槽和进样机构,2.,填灌清洗机构,3.,毛细管,4.,检测器,5.,铂丝电极,6.,低压电极槽,7.,恒温系统,8.,数据记录处理系统,自动型毛细管电泳仪构造示意图,12,CE,的要求：,进样机构不存在死体积，能进展准确的进样把握。,需有毛细管清洗机构。,高压电源至少应能输出200A25kV的功率。,检测器尽量安装在接地端，优先考虑柱上紫外检测方式。,温控范围宽，以0 为界，越宽越好，上限不应低于50 ，最好能到达6570 ，至少能在2040内恒温，恒温精度应小于0.1 。,13,高压电源一般承受0 30kV连续可调的直流高压电源，一般要求电压稳定在0.1%。电极通常由直径0.5mm 1mm的铂丝制成。电极槽通常是带螺帽的玻璃瓶或塑料瓶1ml 5ml不等，以便于密封。,仪器必需接地，操作过程中必需留意高压的安全疼惜。,一、高压电源,14,二、毛细管,1.尺寸,毛细管尺寸的选择与分别模式和样品有关。自由溶液电泳多项选择用50或75m内径的毛细管，分别的有效长度常把握在40100cm之间。如进展大颗粒如红细胞的分别，则需要内径大于 300m的毛细管。CGE或CEC的有效长度一般把握在20cm左右。,2.涂层,外壁涂一层聚酰亚胺疼惜层，一般内壁不需涂层处理。大分子化合物分别时，常常需要惰性管壁，以抑制吸附。做CIEF或CGE时，需要涂层毛细管以抑制电渗。在分别中，有时为了加强电渗或转变其方向，也需要涂层毛细管。,15,3.清洗,毛细管在使用过程可能被污染，从而影响分析的结果。为使测定具有良好的重现性，毛细管在使用时应常常清洗。,空管通常用 0.l1mol/L NaOH、水和缓冲液挨次冲洗，各洗510min，或增加有机溶剂如甲醇清洗步骤，以除去管中的脂溶性吸附组分。假设疑心管内壁吸附有蛋白质或其他有机分子，可用0.l1mol/L的HNO3洗 510min，然后再按常规清洗。,两次分析之间，可用运行缓冲液清洗、平衡。,16,三、进样系统,毛细管通道特殊细小，所需样品不过数nl，所以不能承受色谱的进样方式。通过让毛细管与样品溶液直接接触，然后由重力、电场力或其它动力来驱动样品进入管中。进样量可以通过把握驱动力的大小或时间长短来把握。进样系统必需包括动力把握、计时把握、电极槽或毛细管移位把握等机构。,进样方式：,1、压力法流体力学进样,2、电动法,17,1,、压力进样,也称流淌进样，它要求毛细管中的填充介,质具有流淌性。当毛细管两端置于不同的,压力环境中时，管中溶液即能流淌，将样,品带入。,可用三种方法产生进样动力：正压、负压,管尾抽吸、重力虹吸。,承受压缩空气气体钢瓶可实现正压,进样，并可与毛细管清洗系统共用，多,为商品仪器承受。,优点：压力进样没有偏向问题，,缺点：选择性差，样品及其背景同时被引入,管中，对后续分别可能产生影响。,18,电动进样,当把毛细管的进样端插入样品溶液并加上电场时，组分就会因电迁移和电渗作用而进入管内。,电动进样的把握参数是电场强度E和进样时间t。电场强度E取值多在160kv/60cm 之间；进样时间通常在110s 之间，有时可达1min或更大。,优点：电动进样对毛细管内的填充介质没有特殊限制，属普适性方法，可实现自动化操作。,缺点：电动进样对离子组分存在偏向，降低分析的准确性和牢靠性。,19,四,.,检测器,在毛细管电泳中，毛细管柱内径小通常50m或75m)，区带体积小，仅为nl级，区带迁移速度快，这就对检测器提出了很高的要求。,毛细管电泳要求检测方法必需具有很高的灵敏度和很快的响应速度，且不能引起区带扩张。,常用柱上检测法,20,紫外检测,由于紫外检测器价格廉价，通用性好，石英毛细管柱有良好的紫外透过性，易于实现柱上检测；再加上大多数有机化合物包括蛋白质等生物大分子都含有紫外发色团，所以它是目前应用最广的检测器。但是，由于受毛细管内径的限制，检测灵敏度较低。,固定波长检测器,可变波长检测器,二极管阵列检测器,21,激光诱导荧光LIF,承受激光强度高，准直性好，可聚焦成比毛细管更细的光束射入毛细管内部，激发出强的荧光。,LIF能减小因毛细管壁的散射所引起的背景噪声。,1.,激光器,2.,高压电源,3.,毛细管,4.,单色器,5.,光电倍增管,6.,记录仪,8.,激发光光纤,9.,荧光收集光纤,22,其他检测器,电化学检测器,化学发光检测器,质谱检测器,23,第四节 定性和定量分析方法,一、定性分析方法,以相对迁移时间与比照品比照定性；与质谱联用定性。,二、定量分析方法,1、内标法,2、叠加比照法,24,第五节 毛细管电泳的主要分别模式,毛细管区带电泳capillary zone electrophoresis，CZE,胶束电动色谱micellar electrokinetic chromatography,MEKC),毛细管凝胶电泳capillary gel electrophoresis,CGE),毛细管等速电泳capillary isotachophoresis,CITP),毛细管等电聚焦capillary isoelectric focus,CIF),毛细管电色谱capillary electrochromatography,CEC),25,一、毛细管区带电泳法CZE,毛细管电泳最根本的分别模式。背景电解质是缓冲液，分别是基于样品中各个组分间质荷比的差异。有时需在缓冲液中参与确定的添加剂，用以提高分别选择性，转变电渗流的大小、方向或抑制毛细管壁的吸附等。,在CZE中，影响分别的操作条件为：,分别电压,背景电解质种类、浓度和pH,添加剂种类和浓度,26,分别效率与电压间存在极大值。极大电压通常也是最正确工作电压。,在实际分别中，假设所用的毛细管很细或缓冲液的电导很低，极大电压可能会超出仪器范围，此时没有最正确电压，可选择仪器允许的最大输出电压。,当毛细管较粗或缓冲液电导较高时，极大电压可能很小，假设此时分别度很高，也可选择大于极大值的电压进展分别。,1.分别电压,27,毛细管的温度不仅影响分别的重视性，而且影响分别效率。温度选择应考虑热效应、分析重现性、分别效率和分别介质对温度的限制等因素。,温度确实定也应通过试验，多数状况下，在2030之间进展电泳，能获得良好的分别效果。可依据初步分别结果调整温度。,不少糖类样品需要高于室温的分别环境，一些样品如蛋白等则可能需要低于室温的分别条件。,2.分别温度,28,对背景电解质的要求：,在所选择的pH范围内有足够大的缓冲容量。,在检测波特长的吸取低。,自身的淌度低，即分子大而荷电小，以削减电流的产生。,应使被测组分带适宜的电荷量，以实现有效进样和有适宜的电泳淌度。,尽可能承受酸性缓冲溶液，在低pH下，吸附和电渗流值都很小。,与毛细管种类匹配，涂层毛细管只能在确定pH范围内使用。,3.,背景电解质,29,在CZE中，常用于毛细管电泳的缓冲溶液有硼砂、磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和醋酸盐等。,缓冲体系的pH值要求与样品的性质有关，通常酸性组分的分别选择在碱性条件下进展，而碱性组分则选择酸性介质分别，蛋白质、多肽、氨基酸等两性物质，可选酸性(pH2)也可选碱性(pH9)分别介质。糖类样品通常在pH911之间能获得最正确分别，羧酸或其它样品多在pH59之间选择分别条件。,30,二、胶束电动色谱法MEKC,在缓冲溶液中参与离子型外表活性剂如SDS，当外表活性剂浓度超过其临界胶束浓度时，则形成胶束，胶束具有疏水内核,外层带负电荷。溶质分子则在极性缓冲液与胶束中心的非极性相假固定相之间有确定的安排。,中性分子因其本身疏水性,不同，在两相中安排存在差异。,在电渗流作用下，胶束携带溶,质一起前行，疏水性强的溶质,和胶束结合得较牢，流出慢。溶,质分子由于表观淌度及其在两相,中的安排系数的差异是MEKC分别,的根底。,31,常用的阴离子外表活性剂有十二烷基硫酸钠SDS、N-月桂酰-N-甲基牛磺酸钠LMT、牛磺脱氧胆酸钠STDC等。,阳离子外表活性剂最常用的是季铵盐，如十二烷基三甲基溴化铵DTAB、十六烷基三甲基溴化铵CTAB等。,非离子型外表活性剂有3-3-(氯化酰胺基丙基)二甲基胺基-1-丙基磺酸酯CHAPS等。,另外，还有手性外表活性剂，如胆酸、毛地黄皂苷、十二烷基-N-L-缬氨酸钠等。,32,外表活性剂选择时应考虑以下因素：,1经济易得,2水溶性好,3紫外吸取背景越低越好,4不与样品发生破坏性作用,5所形成的胶束足够稳定,33,三、环糊精修饰毛细管电泳法,将适量环糊精及其衍生物参与缓冲溶液作为添加剂而进展的毛细管电泳。,分别手型异构 体常用的方法。,环糊精，吡喃葡萄糖单元构成锥筒形构造。待分别组