10蛋白酶活力的测定课稿

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十章 蛋白酶活力测定,概 述,蛋白酶定义,水解蛋白质肽链酶类的总称，适宜PH和温度下水解蛋白为肽段和氨基酸。,蛋白酶分类,碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶内肽酶,蛋白酶,分类,作用位点,已知抑制物,氨基肽酶,金属,蛋白酶,带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端；不能分解由X-Pro、D或Q组成的肽键,2,，,2,，,双吡啶，11()-菲咯啉,菠萝蛋白酶,巯基蛋白酶,无特异性,2巨球蛋白，TPCK，TLCK，烷化,羧肽酶A,锌金属蛋白酶,带有自由氨基酸的L氨基酸羧基端；不能分解R、P或羟脯氨酸,EDTA，EGTA,羧肽酶B,锌金属蛋白酶,K，R羧基端,EDTA，EGTA，碱性氨基酸,羧肽酶Y,丝氨酸羧肽酶,氨基酸羧基端,PMSF,组织蛋白酶C,琉基蛋白酶,氨基端双肽，可通过K，R或P氨基端作为第二或第三个氨基酸封闭,醋酸碘，甲醛,胰凝乳蛋白酶,丝氨酸蛋白酶,在F，T或Y之后,抑肽酶，PMSF，TPCK，巨球蛋白,胶原酶,金属蛋白酶,在P-X-G-P肽链中X之后,EDTA，EGTA，还原剂，但无血清存在,dispase,金属蛋白酶,无特异性,EDTA，EGTA，Hg,2+,，重金属,内肽酶Arg-C,丝氨酸蛋白酶,在R之后,巨球蛋白，TLCK,内肽酶Asp-N,金属蛋白酶,在D和半胱氨酸之前,EDTA，菲咯啉,内肽酶Glu-C,丝氨酸蛋白酶,在E或D之后,巨球蛋白，TLCK,内肽酶Lys-C,丝氨酸蛋白酶,在K之后,TLCK，抑肽酶，抑蛋白酶醛肽,肠激酶,丝氨酸蛋白酶,在D-D-D-D-K-肽链中K之后,Xa因子,丝氨酸蛋白酶,在R之后,PMSF，APMSF，大豆胰蛋白酶抑制物,无花果蛋白酶,琉基蛋白酶,无特异性,TPCK，TLCK，-巨球蛋白,激肽释放酶,丝氨酸蛋白酶,在一些R之后,抑肽酶，抑蛋白酶醛肽,木瓜蛋白酶,巯基蛋白酶,长期孵育时具有广泛特异性,TPCK，TLCK，抑蛋白酶醛肽巨球蛋白，烷化剂,胃蛋白酶,酸蛋白酶,广泛特异性,胃蛋白酶抑制素,纤溶酶,丝氨酸蛋白酶,在K或R之后,PMSF，TLCK，抑肽酶，巨球蛋白,链霉蛋白酶,混合型,无特异性,BM完整药片,蛋白酶K,丝氨酸蛋白酶,广泛特异性,PMSF，PefablocSc,枯草杆菌蛋白酶,丝氨酸蛋白酶,无特异性,PMSF，巨球蛋白，苯甲脒,热溶素,锌金属蛋白酶,在非极性残基之前,EDTA,凝血酶,丝氨酸蛋白酶,在K之后,TLCK，PMSF，抑蛋白酶醛肽,抑肽酶，巨球蛋白，苯甲脒,胰蛋白酶,丝氨酸蛋白酶,在K或R之后,TLCK，PMSF，抑蛋白酶醛肽,抑肽酶，巨球蛋白,应用,发酵：发酵酒精时，蛋白水解充分。,皮革脱毛和软化,丝绸脱胶,医药生产,要求,把握测定蛋白酶活力的原理,理解制备标准曲线的目的和意义,学习制备标准曲线的根本操作,一、,原 理,酪蛋白 酪氨酸 钼蓝和钨蓝蓝色,蛋白酶 Folin,PH=10，40,OH,-,680nm,OD,酶活力单位：,1mL液体或1g固体酶粉在确定温度、PH下，每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸，为一个酶活力单位。,福林试剂Folin：钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂金黄色溶液,二、仪器与试剂,1、仪器,电子天平、紫外分光光度计、电热恒温水浴锅,2、试剂,1福林试剂 贮存液和使用液 22%酪蛋白溶液,3pH7.2磷酸缓冲溶液 4100ug/mL标准酪氨酸溶液,50.4mol/L碳酸钠溶液 60.4mol/L三氯乙酸溶液,7c1/2 Na2CO3=0.8mol/L Na2CO3溶液,8cHcl=1mol/mL Hcl 溶液,三、测定方法,1、标准曲线的绘制,取6支10mL具塞比色管，编号，按下表将酪氨酸溶液稀释，配制酪氨酸系列标准溶液：,10,8,6,4,2,0,0,20,40,60,80,100,0,2,4,6,8,10,1,2,3,4,5,6,蒸馏水,(ml),稀释后的酪氨酸,标准溶液浓度（ug/ml）,酪氨酸溶液（100g/mL）mL,试管,编号,于上述各管中各吸取1mL于10mL比色管中，分别参与5mL0.4mol/mL碳酸钠溶液、1mL Folin试剂使用液。摇匀，40毒水浴显色20min后，680mn测定吸光度。以吸光度值和酪氨酸浓度绘制标准曲线。,以光密度OD为纵坐标，酪氨酸含量g,为横坐标，绘制标准曲线。,酪氨酸标准曲线,y=0.0011x,R,2,=0.9999,0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0,100,200,300,400,500,600,700,酪氨酸含量ug,光密度,2、待测酶液的制备称取、溶解、稀释,称取0.1g酶粉，用pH7.2磷酸缓冲溶液溶解并定容至100mL，吸取5mL，再用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释定容至250mL，即稀释500倍待测。,3、样品测定,第一步,操作步骤,加预热酶液/,mL,加预热2%酪蛋白溶液/,mL,保温显色/min,加0.4mol/mL三氯乙酸溶液/mL,保温/min,操作步骤,加预热酶液/,mL,加0.4mol/mL三氯乙酸溶液/mL,保温显色/min,加预热2%酪蛋白溶液/mL,样品管号,1 2 3,空白管号,1 2 3,1.0,10,2.00,20,1.00,2.00,10,1.00,第二步,操作步骤,加对应的离心上清液/,mL,c（1/2 Na,2,CO,3,）=0.8mol/L Na,2,CO,3,溶液,/mL,加Folin试剂使用液,/mL,保温显色/min,吸光度值,平均吸光度值,样品管号,1 2 3,空白管号,1 2 3,1.0,5.00,1.00,20,1.0,5.00,1.00,20,以空白为比照，680mn测定吸光度值，求平均值。,从标准曲线上找到酪氨酸的质量A，ug；,酪氨酸质量，ug,OD,y=k x,测得的OD值,A=？,四、计算,样品蛋白酶活力单位(以干基计)=4 n,A,10,1,（1-w）,式中,A标准曲线上查的酪氨酸质量，ug；,44mL反响液取出1mL测定；,N酶液稀释倍数；,W样品中水分，%。,留意,严格按挨次参与试剂。,先加NaCO3，再加Follin试剂，后者只有,在碱性条件下才能被复原成兰色物质。,说明：酪蛋白在低温下有少量降解为酪氨酸，,此操作是与测定样品的条件保持全都，,消退系统误差。,留意：滤纸不能润湿。,校正：,用紫外分光光度计，以蒸馏水作比照，在680nm处测定光密度。用1-6号管的光密度值减去0号管的光密度值。,end,【试验结果】,一、原理,一、酶活力的定义,酶活力是指酶催化某些化学反响的力气,二、酶活力和酶促反响速度的关系,酶活力的大小可以用在确定条件下它,所催化的某一化学反响的速度来表示,测定酶活力就是测定酶促反响的速度,【试验原理】,三、酶促反响速度的测定方法及条件,通常用单位时间内,产物的生成量表示,酶促反响的速度。,必需测定酶促反响,的初速度。,时间（t）,酶促反应速度（v）,