微生物学实验-1-口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色剖析课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,微 生 物 学 实 验,微 生 物 学 实 验,1,微生物学实验应当掌握,1、微生物的,观察,方法（制片、染色、油镜的使用）,2、微生物的,培养,方法（培养基配制、分装、包扎、灭菌）,3、,无菌操作技术,（火焰灭菌、倒平板、划线、涂平板、接种）,微生物学实验应当掌握1、微生物的观察方法（制片、染色、油镜的,本课程的成绩考核：,基础实验：60%,由,单个实验的成绩相加,组成。每次实验由实验指导老师根据出勤、实验操作、实验报告等进行评定，具体比例为：,实验出勤及实验态度占20；实际操作30；实技能考核30；实验报告占20。,自主设计实验：40%,设计实验方案,实验操作,总结,本课程的成绩考核：基础实验：60%,实验一,细菌的革兰氏染色,实验目的,实验原理,实验材料,实验方法,实验结果,注意事项,实验报告,思考题,微生物学实验-1,实验一 细菌的革兰氏染色 实验目的微生物学实验-1,4,1.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。,2.学习并掌握革兰氏染色技术，进一步熟练光学显微镜油镜的使用技术。,实验目的,1.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。,革兰氏染色法（,Gram staining,）是微生物学中常用的一种染色方法，该染色法由丹麦医生（Christian Gram）于1884年创立，故名。,实验原理,革兰氏染色法（Gram staining）是微生物学中常,G,+,细菌,G,-,细菌,G+细菌G-细菌,革兰氏染色机理,G,+,细菌由于,细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密,，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，因不含脂类，故,乙醇处理不能在壁上溶出缝隙,，因此，,结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在其细胞内,，使其,呈现紫色,。,G,-,细菌因其,壁薄、肽聚糖含量低和交联松散,，故遇乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，加上它的类脂含量高，所以当,乙醇把类脂溶解后,，在,细胞壁上就会出现较大的缝隙,，结晶紫与碘的复合物极易被溶出细胞壁，因此，通过乙醇脱色后，细胞又,呈无色,。这时再经番红复染，就使G,-,细菌染成,红色,，而G,+,细菌仍呈紫色。,革兰氏染色机理 G+细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较,结晶紫初染,全部细胞紫色,碘液媒染,全部细胞紫色,乙醇脱色,G,-,菌,无色,G,+,菌紫色,番红复染,G,-,菌,红色,G,+,菌紫色,革兰氏染色各步骤时细菌的外观,结晶紫初染全部细胞紫色碘液媒染全部细胞紫色乙醇脱色G-菌无,结晶紫初染,碘液媒染,乙醇脱色,番红复染,结晶紫,碘液,乙醇,番红,结晶紫初染 碘液媒染 乙醇脱色 番红复染结晶紫碘液乙醇,菌种,大肠杆菌（,Escherichia coli,）,金黄色葡萄球菌（,Staphylococcus aureus,）,试剂：,蒸馏水；草酸铵结晶紫染液；卢戈氏碘液,95%乙醇；番红复染液；香柏油；二甲苯,光学显微镜,实验材料,菌种 实验材料,革兰氏染色操作步骤,水洗,干燥,镜检（油镜）,涂片,滴水,取菌,火焰固定,结晶紫染色,1分钟,水洗,碘液1分钟,乙醇脱色（2030秒）,水洗,番红1分钟,水洗,实验方法,自然干燥,革兰氏染色操作步骤水洗干燥 镜检（油镜）涂片滴水取菌,微生物学实验-1-口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色剖析课件,E.coli,S.,aureus,混合菌,涂片方法示意图,E.coliS.aureus混合菌涂片方法示意图,微生物学实验-1-口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色剖析课件,分辨率 D=,数值孔径 NAnsin,a,n=1.515,空气n=1,2NA,2,a,分辨率 D=an=1.515空气n=12NA2a,电源,电源,电源电源,显微镜油镜的使用与保护,插上电源插头，打开显微镜电源开关。,调节显微镜光源。,先用低倍镜、高倍镜查找标本视野，下降载物台约2cm，加,香柏油,一滴于标本的待检部位，换用油镜观察。,换用油镜后，眼睛从侧面注视油镜头，缓慢上升载物台至油圈不再扩大为止，此时镜头几乎与装片接触，但不可压及装片。,观察标本时，双眼同时挣开，左眼观察，右眼画图。,油镜用毕，转动粗调将载物台下降，取下标本，用,擦镜纸,沾少许,二甲苯,将镜头擦净，然后再用,擦镜纸,擦去,二甲苯,。,7.使各部分还原，物镜镜头呈八字形，光源强度调至最暗，关闭电源，罩上防尘罩，收拾干净台面。,显微镜油镜的使用与保护插上电源插头，打开显微镜电源开关。,微生物学实验-1-口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色剖析课件,金黄色葡萄球菌,(G,+,),大肠杆菌,(G,-,),实验结果,金黄色葡萄球菌(G+)大肠杆菌(G-)实验结果,大肠杆菌(G,-,)和金黄色葡萄球菌(G,+,),大肠杆菌(G-)和金黄色葡萄球菌(G+),注意事项,1.涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；,自然干燥,后再进行火焰固定（以玻片不烫手为宜）。,2.染色过程中勿使染色液干涸。,3.乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，会使阳性菌被误染成阴性菌。,4.选用培养1824h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使会使革兰氏阳性菌转成阴性反应。,注意事项1.涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；自然,实验报告,Escherichia coli,10100,Staphylococcus aureus,10100,混合菌 10100,实验报告Escherichia coli 10100,1通过本实验你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？,思考题,1通过本实验你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其,实验二,口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用,实验目的,实验原理,实验材料,实验方法,实验结果,注意事项,实验报告,思考题,微生物学实验-1,实验二 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用 实验目的,25,学习并初步掌握细菌的单染色法。,了解口腔内微生物的种类。,掌握油镜的使用方法。,实验目的,学习并初步掌握细菌的单染色法。实验目的,细菌的单染色法是微生物学中常用的一种染色方法。,人体口腔中,特别是在牙垢中，,有,细菌、真菌、支原体、口腔原虫、病毒等数量众多的微生物，用无菌牙签刮取少许牙垢，涂片染色后用显微镜下即可观察到各类微生物的形态。,实验原理,细菌的单染色法是微生物学中常用的一种染色方法。实验,试剂：,蒸馏水；石碳酸复红染液；香柏油；二甲苯,光学显微镜、灭菌牙签、载玻片,实验材料,试剂：实验材料,口腔微生物染色操作步骤,干燥,镜检（油镜）,涂片,滴水,刮取牙垢,火焰固定,革兰氏染色或 复红染色1分钟,水洗,实验方法,自然干燥,口腔微生物染色操作步骤干燥镜检（油镜）涂片滴水刮取牙垢火焰固,实验结果,实验结果,微生物学实验-1-口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色剖析课件,微生物学实验-1-口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色剖析课件,注意事项,1.载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。,2.取样时只需轻刮牙齿表面，肉眼可见少许牙垢即可，滴水不宜过多，以免干燥时间过长；涂片不宜过厚，以免水洗不完全造成背景杂乱。,3.,自然干燥,后再进行火焰固定（以玻片不烫手为宜）。,4.染色过程中勿使染色液干涸。,注意事项1.载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。,实验报告,口腔中的微生物,10100,实验报告口腔中的微生物 10100,1油镜观察时为何要使用香柏油？油镜的放大原理是什么？为何要等载玻片上的水分完全干燥后才进行油镜观察？,2谈谈本次实验过后，你对口腔中微生物的认识。,思考题,1油镜观察时为何要使用香柏油？油镜的放大原理是什么？为何要,微生物学实验,微生物学实验,