未培养微生物课件

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,sss,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,未培养微生物,未培养微生物,1,1887,年,-,现在,琼脂,培养皿,固体培养,科赫,（,1843-1910,）,1887年-现在琼脂培养皿固体培养科赫,2,病原微生物,工业微生物,固体培养基分离,病原微生物固体培养基分离,3,（海水）,（淡水）,（湖水）,（河口水）,（活性污泥）,（沉积物）,（土壤）,显微镜下,固体培养基上,同一环境样品,（海水）（淡水）（湖水）（河口水）（活性污泥）（沉积物）（土,4,那为什么大部分微生物到现在还没培养出呢？,？,那为什么大部分微生物到现在还没培养出呢？,5,贫营养环境,饿,饿,1.,培养基中营养物质浓度太高,胰蛋白胨,10 g,酵母提取物,5 g,氯化钠,10 g,LB,培养基（,1 L,）,营养物质过量,(J Biosci Bioeng,2005,485-492),贫营养环境饿饿1.培养基中营养物质浓度太高胰蛋白胨 1,6,降低培养基中营养物质浓度,一般在低营养条件生长的微生物，,其,生长速度不可能像大肠杆菌那么快。,增加培养时间,在低营养物质条件培养时，,需要增加培养时间到一周或,一个月甚至更长,降低培养基中营养物质浓度,7,培养基中,高浓度,的,有机营养物质,会,限制,一些微生物的生长,制作固体培养基时常用的琼脂,会不会,限制一些微生物的生长呢,？,培养基中高浓度的有机营养物质会限制一些微生物的生长？,8,2.,琼脂不一定适合于大部分微生物,生长,(Appl Environ Microbiol,2005,2162-2169),2.琼脂不一定适合于大部分微生物生长(Appl Envir,9,(Appl Env,Microb,2017,e01366),磷酸盐,过氧化氢,琼脂,磷酸盐,过氧化氢,高压灭菌,(Appl Env Microb,2017,e01366,10,分离出新的目（,order,）的,细菌,(Appl Environ Microbiol,2018,e00807),对固体培养基灭菌时,可以把琼脂和磷酸盐分开灭菌,温度降到一定程度后混合,琼脂和磷酸盐,分开灭菌,琼脂和,磷酸盐,一起灭菌,土壤样品,沉积物,样品,分开灭菌,分开灭菌,一起,灭菌,一起,灭菌,解决方法,分离出新的目（order）的细菌(Appl Environ,11,漂浮滤膜（,floating filter,）法,稀释样品过滤,滤膜,漂浮,在,液体培养基上,菌落,挑选,不依赖固体培养基获得单菌落,漂浮滤膜（floating filter）法稀释样品过滤滤膜,12,把样品稀释后进行涂布培养，挑选一个个单菌落接种到新的培养基时，,好多菌,长不出来,？,缺少部分微生物生长需要的营养物质,3,.,固体培养时微生物间联系被断开,把样品稀释后进行涂布培养，挑选一个个单菌落接种到新的培养基时,13,3,.,固体培养时微生物间联系被断开,产铁载体,(siderophore,),的,菌帮助其它菌的铁吸收,(,J Bacteriol,2012,，,4151-4160,),Helper,菌株,挑选单菌落接种到新培养基上不长,互养共栖,(Cross-feeding),提供自己代谢产物给其它菌，,帮其它菌降解,其,有毒代谢产物，,微生物间的群体感应,(quorum sensing),，,互养共栖：,3.固体培养时微生物间联系被断开产铁载体(sideroph,14,(,Biotech Bioeng,2008,286-294),厌氧氨氧化菌的富集培养,产氢细菌,利用有机酸,产氢,后，以氢为底物的,产甲烷菌,会,用掉氢气,，使得产氢细菌易于进一步利用有机酸。,利用不同类型产氢细菌共培养，,分离,多种以,氢气,为底物的产甲烷菌,共培养（,co-culture,）,富集培养（,enrichment,）,(,Biotech Bioeng,2008,286-294),(Biotech Bioeng,2008,286-294,15,微生物,vs,微生物,微生物,vs,环境,提供跟,原生境接近,的生长环境,微生物 vs 微生物提供跟原生境接近的生长环境,16,高通量培养芯片（,Ichip:incubation,chip,）,(Appl Env,Microb,2010,2445-2450),(,Science,2002,1127-1129,),缩小环直径到孔程度,环状铁片两侧用滤膜封闭，但中间层加不同稀释度稀释的土壤样品，之后把这个封闭的铁环放入实际土壤中。环境中的营养物质和微生物代谢产物可通过滤膜交换，但铁环中间加进的菌不能逃到外边，外边的菌也不能进去。,通过这种方法，就可以火大可培养微生物的范围。,通过这种液体培养方法得到特定微生物占主导的培养体系后，,可通过多种物理方法进一步富集或分离目标微生物了。,高通量培养芯片（Ichip:incubation chip,17,密度梯度离心,(Method Enzymol,2005,34-57),通过物理方法进行进一步的富集或分离,流式细胞仪,(FACS,),分选,密度梯度离心(Method Enzymol,2005,3,18,1.,培养基中营养物质浓度太高；,稀释培养基中营养物质，增加培养时间；,2,.,固体培养基中琼脂影响一些微生物生长；,用其它凝固剂代替琼脂,，,或,琼脂和磷酸盐分开,灭菌,，,或,用,漂浮,滤膜法,等获得,单,菌落,；,3.,固体培养打断了微生物间或与环境的协同作用；,通过共培养、富集培养、或拟实际环境条件培养维持协同作用,并,通过物理方法进行进一步的富集或分离。,常用固体培养基的局限性和解决方法,1.培养基中营养物质浓度太高；稀释培养基中营养物质，增加培,19,1977,年,根据,rRNA,序列，,Carl Woese,建立,“三域学说”,1.,基于“通用”引物的微生物群落结构分析方法,2014-100 divisions,30/,70,不依赖于培养的分子生物学方法,1984-89,年,伯杰氏细菌系统学手册,：,表型,遗传,1991,年,Norman,R.,Pace,构建,rRNA,克隆,文库来,分析,海洋微生物的菌群,分布,基于“通用”引物,PCR,扩增的分子生物学,分析广泛应用于微生物生态学研究,Carl Woese,(19282012),此方法完全摆脱了微生物培养的限制去认识环境中存在的微生物。,1977年 根据rRNA序列，Carl Woes,20,通用引物,PCR,产物的高通量测序,barcode,一个样品的一般测序量从建克隆文库时的,几十条,增加到现在的,几万甚至几百万条。,那是不是我们对环境中存在的所有微生物,都可以检测了,？,通用引物PCR产物的高通量测序barcode一个样品的一般测,21,（,Nature Microbiol 2016,e15032,）,对,6000,多,个,宏,基因组,数据,集,分析“通用”,引物覆盖,度,但,大部分,“通用”,引物只能,覆盖,90%,的细菌,（Nature Microbiol 2016,e15032,22,2.,基于单细胞测序和宏,基因组,分析,的暗物质微生物的发现,用多个环境样品,的,单细胞,基因组,测序,确认,了细菌的,21,个候选门,和古生,菌的,8,个候选,门,。,用同样方法，,从,各种水体,中,发现,47,个新的细菌候选门,，,其中,46,个是以前基于“通用”引物,的,16S,rRNA,基因分析中未被检测到,的,。,(Nature Comm,2016,7,13219),(Nature,2013,499,431-437),(Nature,2015,523,208-211),伯克利大学,Banfield,课题组,用,0.1,m,孔径,滤膜,去过滤,已通过,0.2,m,孔径滤膜的,水体,，,并,进行,元基因组分析,，,发现了,包括,25,个,以上,新,细菌,候选,门的,CPR,超,门,（,superphylum,）。,CPR,超门,(Nature Microbiol,2016,1,16048),2.基于单细胞测序和宏基因组分析的暗物质微生物的发现用多个,23,古生菌,到,2011,年,，,通过基于“通用”引物的,PCR,扩增,，已,扩展到,5-6,个门。,近几年随着,宏,基因组分析和单细胞测序技术的,发展,，,古生菌已增加到,20,多个,门,。,把,广古菌门外的其它门区分为,DPANN,，,Asgard,，,TACK,三个超,门,。,接近,于真核生物的,Asgard,超门的,发现,，,挑战,了,三,域,学说,。,到,2002,年，,广古菌,和,泉古菌,两个,门,。,(Science,2017,357,eaaf3883,),古生菌到2011年，通过基于“通用”引物的PCR扩增，已扩展,24,未培养微生物的培养方法和利用,不依赖于培养的分子生物学方法,去认识未培养微生物的思路。,总结,未培养微生物的培养方法和利用不依赖于培养的分子生物学方法,25,对未培养微生物的研究,使人们对微生物的认识更上一层楼，,并,给微生物资源的利用带来飞跃发展！,对未培养微生物的研究使人们对微生物的认识更上一层楼，并给,26,