第15章 干细胞技术

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第15章 干细胞技术,15.1 干细胞的定义和分类,15.2 干细胞的生物学特点,15.3 干细胞的别离和培养,15.4 干细胞技术的应用前景和存在问题,15.1 干细胞的定义和分类,定义,干细胞是来自胚胎、胎儿或成体内的，在一定条件下具有无限自我更新和增殖能力以及不同程度分化潜能的一类细胞。,形态特点：圆形或椭圆形、体积小、核质比例大。,增殖特点：,缓慢性：干细胞增殖速度一般较慢。但当机体需要，干细胞进入分化期时，其增殖速度加快。这种缓慢增殖特点有利于细胞对特定的外界信号作出反响，以决定进行增殖还是进入特定分化程序；此外缓慢增殖还可以减少基因发生突变的可能性。,自稳性：指干细胞会自我更新维持自身数目的稳定。是区别于肿瘤细胞的一个本质特征。,15.1.2 分类,1根据干细胞的来源分类,1胚胎干细胞：由胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养别离出来的一种细胞，是可以分化成任何一种组织类型的细胞。,2成体干细胞：存在于已分化组织中的未分化细胞，能自我更新并可特化形成相应组织的细胞。,干细胞,胚胎干细胞ESC,内细胞团,原始生殖细胞,成体干细胞ASC,：骨髓、大脑、皮肤、胰腺、角膜、肝脏、心脏等组织源干细胞。,2根据分化潜能分类,1全能干细胞：具有发育成完整个体的分化潜能的细胞。如哺乳动物的受精卵。,2多能干细胞：具有产生多种类型细胞的能力，但不能发育成完整个体，发育潜能受到一定限制。,3单能干细胞：只能向一种类型或密切相关的两种类型细胞分化。,15.2 干细胞的生物学特点,具有自我更新能力和不同程度多向分化潜能；,属非终末分化细胞,能无限分裂、增殖,对称分裂和非对称分裂方式生长,1胚胎干细胞生物学特点,1具有发育的全能性,2具有种系传递能力，具有形成嵌合体动物的能力。,2成体干细胞生物学特点,1临床上用于自体移植，可防止免疫排斥；,2通常处于静止状态，只有在病理状态或外因诱导下才具不同程度再生和更新能力；,3分化潜能局限，易向特定组织细胞分化；,4有向同种组织损伤部位迁移的趋势。,15.3 胚胎干细胞的别离和培养,15.3.1 胚胎干细胞的别离：,1主要从早期胚胎(从胚泡中别离内细胞团获得,不同动物选择胚胎发育时机不同：小鼠选用3.5d囊胚,兔子3.5-4d囊胚，人7-8d囊胚，绵羊8-9d囊胚，猪9-10d的囊胚。,从胚泡中别离内细胞团的方法主要有：,免疫外科学方法：通过抗体对细胞的作用，去除滋养层细胞，保存ICM细胞进行培养的方法。,显微外科学方法：取受精后3-4天胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养的方法。,组织培养法：利用滋养层细胞核ICM细胞的不同生长特性滋养层细胞铺展生长，ICM细胞垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，显微镜下进行别离。,2从原始生殖细胞中获取,哺乳动物原始生殖细胞最早出现在靠近尿囊基部的卵黄囊内胚层内，随着后期胚胎的纵向折转，卵黄囊这局部成为胚胎的后肠，其中的原始生殖细胞由此做变形运动，向生殖嵴移动。,所以原始生殖细胞的获得主要取原始生殖细胞移动到的相应组织。例如小鼠取12.5天胎儿的生殖嵴等，将组织剪碎，消化，制成细胞悬液接种培养。,15.3.2,胚胎干细胞的培养,ES细胞的分化抑制培养,ES细胞在体外培养中极易分化和失去二倍体核型，进而失去全能性核形成嵌合体动物能力。,ES细胞的分化抑制培养首要解决的问题是阻止引起分化的基因的激活与表达，抑制分化，保证细胞的全能性。,细胞分化抑制物主要有三种：饲养层细胞；条件培养液；分化抑制因子。,胚胎干细胞的培养方法：,饲养层细胞培养法,主要应用小鼠胚胎成纤维细胞MEF和小鼠成纤维细胞无限系STO作为饲养层细胞，经射线或丝裂霉素C等有丝分裂抑制剂处理后，与早期胚胎或原始生殖细胞在5%CO2，37-39条件下共同培养。MEF和STO都能分泌促进胚胎干细胞增生和抑制胚胎干细胞自主分化的因子，如白血病抑制因子LIF。,无饲养层细胞培养法,在根底培养基一般为DMEM培养基中添加15%胎牛血清参加分化抑制因子LIF或某些特定细胞的条件培养液大鼠肝细胞条件培养液、大鼠心肌细胞条件培养液等，可替代饲养层细胞。,15.3.3 ES细胞系的建立和保存,(1)ES细胞的别离：将ICM细胞经消化液分散后接种于饲养层上或条件培养基中进行分化抑制培养，获得ES细胞。也可对桑葚胚卵裂球或原始生殖细胞进行分化抑制培养获得ES细胞。,(2)ES细胞的扩增培养与细胞系的建立：将别离得到的ES细胞用消化液消化，分散成小细胞块进行分化抑制培养。经屡次继代培养筛选出能大量增殖的ES细胞系。,ES细胞系一旦建立便迅速增殖，一般18-24h分裂一次，每2天需更换一次培养液，每3-4天传代一次。因为聚集在一起的细胞团会刺激细胞分化，传代过程中一定注意保持单细胞状态。,(3)ES细胞的冷藏：,长期培养ES细胞也会出现变异现象，因此ES细胞建系成功后，需要冷冻保存，使用时再将其解冻。,ES细胞系的建立,15.3.4 胚胎干细胞系的鉴定,1形态学特征,2碱性磷酸酶AKP活性,3OCT基因表达,4体外分化潜能,5体内分化潜能,6嵌合体形成能力,15.3.5 胚胎干细胞的诱导分化,与动物细胞培养方法相同，但需要在获得分散的悬浮细胞后接种时参加相应的诱导剂来诱导分化的进行。,1单层ES细胞诱导分化,将ES细胞经0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞；,以2104-5104个细胞/mL密度接种于0.1%明胶包被的培养皿；,培养液中撤除LIF并添加适当浓度细胞分化诱导剂诱导分化。单层培养的ES细胞较难分化为单一类型的细胞,2EB细胞形成和诱导分化,软琼脂培养,将ES细胞经0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞；,以2104-5104个细胞/mL密度接种于1%软琼脂铺底的培养皿中；,ES细胞悬浮培养生长并增殖成细胞团，外层分化为内胚层，称为简单类胚体SEB。,悬滴培养,将ES细胞经0.25%胰蛋白酶消化后制成4104个细胞/mL密度的单细胞悬液。,以20微升/滴接种于培养皿盖内外表，培养皿内加适量PBS溶液，置于37、5%CO2培养箱中培养，3天后ES细胞形成EB。,诱导分化,将上述方法获得的EB移入铺有0.1%明胶的培养皿或多孔培养板内，添加诱导物进行诱导分化。EB不断向外生长，分化出不同类型的分化细胞。,15.4 干细胞技术应用前景,探讨胚胎发育的调控机制。,胚胎干细胞修复甚至替换丧失功能的组织或器官。,结合克隆技术，创立病人特异性胚胎干细胞，克服免疫排斥反响。,动物克隆及改进,细胞和基因治疗：直接用干细胞移植治疗疾病。或通过基因工程技术将正常基因替代干细胞中的缺陷基因，再将修复后的胚胎干细胞嵌入胚胎中，产生健康婴儿。,组织工程的种子细胞来源,建立药物筛选和研究平台,15.5 干细胞研究中存在问题,对维持干细胞未分化状态的机制和干细胞定向诱导分化的调控机制尚不清楚。,干细胞应用于临床治疗的平安性问题。,ES细胞真正用于器官克隆与移植仍有待于技术上的突破。,胚胎干细胞应用于细胞和组织替代治疗目前还面临免疫排斥问题及一系列社会学核伦理学问题。,对成体干细胞的可塑性研究目前处于初始阶段。,思考题,什么是干细胞？可分为哪些主要类型？,简述,ESC,和,ASC,的特点。,什么是成体干细胞的可塑性？关于其机制目前主要有哪些解释？,简述,ES,细胞建系的主要操作步骤。,怎样鉴定,ES,细胞？,ES,细胞诱导分化方法有哪些？,简述干细胞技术的应用前景和存在问题。,