电穿孔简介课件

Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,电穿孔简介,Gene Pulser Xcell,1,1,电穿孔的工作原理是什么?,电穿孔的基本原理是将细胞置于一个瞬时的高电场的环境中，此高电场的环境使得细胞膜的表面出现很多小孔，这种条件下细胞膜对于环境中分子的透性大大增加，这样就可以将外源分子进入细胞。,利用上述的原理，那么采用电穿孔的方法就可将,DNA,等其他类的生物分子导入细胞内部进行研究，如蛋白分子、糖类分子等等。,2,电穿孔的工作原理是什么?2,采用电穿孔的优点,本质上属于物理的方法，不采用任何化学试剂，因此不会对细胞产生损伤,操作方便,低毒性,高的转染效率,使用于种类广泛的细胞,3,采用电穿孔的优点本质上属于物理的方法，不采用任何化学试剂，因,电穿孔的主要应用,导入标记基因，起到标记、指示的作用,导入具体的功能基因进行研究,导入药物、蛋白、抗体等其他分子对细胞的结构和功能进行研究,4,电穿孔的主要应用导入标记基因，起到标记、指示的作用4,具体的工作原理?,将细胞和外源,DNA,混合后一起放在电击杯内,电击杯被加上电压后，细胞膜进行重排，细胞表面出现很多小孔,外源,DNA,分子通过上述形成的小孔进行细胞内部,当外界的电场撤消后，细胞膜表面的小孔重新关闭，这时阻止外界的分子再进入细胞,5,具体的工作原理?将细胞和外源DNA混合后一起放在电击杯内5,Gene,Pulser,Xcell,电穿孔系统,6,Gene Pulser Xcell电穿孔系统6,主要的优点、特点,提供指数波和方波2种电穿孔条件，可对任何的真核细胞、原核细胞的电转染实验条件进行优化,采用,Bio-Rad,专利的,PulseTrac,电路和电弧保护设计，可确保实验的重复性并保护样品,模块化的设计可方便用户根据不同的实验要求进行选择,友好的数字化界面，可直观的编程控制所有的参数，包括附属模块的参数,提供多种操作模式，包括手动设置、预设模式、用户编程等多种方式,7,主要的优点、特点提供指数波和方波2种电穿孔条件，可对任何的真,主要的优点、特点：2种波型,电穿孔的过程中可以有2种波型来控制外界电压的变化,The Gene Pulser Xcell,可以提供2种波型，即指数波和方波,8,主要的优点、特点：2种波型电穿孔的过程中可以有2种波型来控制,Exponential Decay,电容器充电到预定的电压,(v,0,),放电后，即向样品释放脉冲，细胞表面的电压随时间按指数方式下降的,电容器的电压值达到峰值释放脉冲后迅速的衰减,电场强度,E(V/cm),是用来描述电击杯外界电场环境的一个参数（,E=V/d）,脉冲时间是一般用时间常数来进行衡量,(37%of V,0，,V,0,/e),脉冲的时间是由电阻和电容的大小所决定的,9,Exponential Decay电容器充电到预定的电压(v,GPX,和指数波,GPX,产生指数波的电路结构,Charger,充电回路,放电回路,电容器,电击杯,3,ohm,电阻,基本电路,10,GPX和指数波GPX产生指数波的电路结构Charger充电回,GPX,和指数波,GPX,产生指数波的电路结构,Charger,充电回路,放电回路,电容器,电击杯,3,ohm,电阻,r,充电,根据具体电压及电容的选择，可以采用主单元或者,CE,模块对电容进行充电,11,GPX和指数波GPX产生指数波的电路结构Charger充电回,GPX,和指数波,GPX,产生指数波的电路结构,Charger,充电回路,放电回路,电容器,r,电击杯,3,ohm,电阻,放电,The charge is delivered to the cuvette,12,GPX和指数波GPX产生指数波的电路结构Charger充电回,PulseTrac,电路是如何确保每次实验电压的精确度及实验的重复性,在每次放电前，,PulseTrac,电路都会预测整个放电回路的电阻值，并计算得到应该加在电容器上的电压，确保放电后样品上获得的电压和理论电压值的一致,在放电回路中3欧姆的电阻可以起到减小回路中电流的作用，适当的保护样品,注意：,PulseTrac,回路技术是,Bio-Rad,公司的专利技术，其他任何厂家都不能提供,13,PulseTrac 电路是如何确保每次实验电压的精确度及实验,PC,模块的结构与原理?,电流会经过电阻最小的通路,PC,模块中的电阻决定了脉冲过程中的时间常数，电阻越小，放电时间越短,Charger,充电回路,放电回路,电容器,Cuvette,3,ohm,电阻,r,PC,模块,并联电阻,当样品的电阻远远大于,PC,模块的电阻时，则,PC,模块的电阻约等于放电回路的电阻,14,PC模块的结构与原理?电流会经过电阻最小的通路Charger,方波,电容器的指数放电过程中被截止后就会形成方波，其时间常数远大于脉冲时间,脉冲时间就是细胞被放电的时间,脉冲是可以被反复释放的，在低压回路最多可以重复10次，在高压回路最多可以重复2次,脉冲的间隔时间就是指2个脉冲间的时间,脉冲下降是指终止电压和起始电压值之间的差值,15,方波电容器的指数放电过程中被截止后就会形成方波，其时间常数远,GPX,和方波,高电压回路:,一次充电，一次脉冲。在下一次脉冲前，电容器需要重新充电,最多只能进行2次脉冲，脉冲时间为,0.05 5msec，,脉冲间隔为,5-30sec,低电压回路:,该电路是可调的，因此可一次充电，进行多次的脉冲,最多可进行10次脉冲，脉冲时间为,0.05-100msec，,脉冲间隔为 0.1 10,sec,16,GPX和方波高电压回路:16,特点:,PulseTrac,电路和电弧保护,PulseTrac,电路确保样品上所加电压的精确度,将,CE,模块中的低压电容器的精度从20%提高到10%,电容器的校正方便，确保每次脉冲的精确，并且能修正随着使用而产生的电容器指标的偏差,在每次脉冲前就能预测样品的电阻,当脉冲或电路中断时，可进行安全的放电，确保安全,电弧保护设计，确保设备和样品的安全,17,特点:PulseTrac电路和电弧保护PulseTrac电,什么是电弧保护?,在电击杯中出现电阻特别小的区域时，就会形成短路，产生电弧。样品缓冲液中的离子成分就会造成电弧现象,只要上述电阻突然变小的情况被检测到，那么电流就不会经过样品,电弧保护就是在存在短路的情况下，使电流不经过样品，确保样品不受强电流的损伤,如果样品量很少的话，那么产生的热量会使得样品蒸发,如果由于样品的低电阻而产生电弧，那么,GPX,会给出提示，并不能提供脉冲,Ions collect,above sample,18,什么是电弧保护?在电击杯中出现电阻特别小的区域时，就会形成,特点:模块化设计,主机,CE,模块,PC,模块,ShockPod,电击槽,系统部件,19,特点:模块化设计主机CE模块PC模块ShockPod电击槽,特点:友好的操作界面,图表化的操作界面可以设置所有的实验参数，包括附属模块的参数,20,特点:友好的操作界面图表化的操作界面可以设置所有的实验参数,特点:可选择的程序设置,HOME,1.Exponential protocol,2.Time constant protocol,3.Square wave protocol,4.Pre-set protocols,5.User protocols,HOME,6.Last pulse,7.Optimize,8.Data management,9.Measurements,10.User preferences,主菜单,21,特点:可选择的程序设置HOMEHOME主菜单21,1.指数波,程序显示,结果显示,22,1.指数波程序显示结果显示22,2.时间常数确定的指数波形式,程序显示,结果,23,2.时间常数确定的指数波形式程序显示结果23,3.方波,程序显示,结果显示,24,3.方波程序显示结果显示24,4.,GPX,内部预设程序,Mammalian Cells,Bacterial Cells,Fungal Cells,CHO,E.coli,S.cerivisiae,Cos7,A.tumefaciens,P.pastoris,3,T3,P.aeruginosa,C.albicans,293,S.aureus,S.pombe,HeLa,B.cereus,D.discoideum,BHK21,S.pyogenes,A549,L.plantrum,CV1,K562,HL60,Jurkat,HuT78,对于常规的细胞，经过优化的电穿孔条件,25,4.GPX内部预设程序Mammalian CellsBac,5.用户自储存的程序,最多可储存144个程序,12个人，每人12个程序,可按照名字储存,可修改或删除,26,5.用户自储存的程序26,6.最后一次电穿孔的条件,即使关机后，,GPX,还是可以调出仪器最后一次电穿孔的条件，并利用该程序进行实验。方便实验室最常用程序的使用,27,6.最后一次电穿孔的条件27,7.实验条件的优化,可用于方便的优化实验条件，可连续的对脉冲条件中的电压某一个参数进行优化,该功能可在指数波、方波、特定时间常数的指数波模式下使用,28,7.实验条件的优化可用于方便的优化实验条件，可连续的对脉冲,8.实验数据管理,数据管理,可以调出之前的100个实验程序,显示每个程序的设置条件和结果,29,8.实验数据管理数据管理29,9.仪器的测量功能,该功能使用户可以在日常的工作中经常对,GPX CE,模块电路中的电容器进行校正，确保实验的精确，具体的步骤如下：,断开,ShockPod,电击槽,连接,CE,模块,按下操作面板上的小数点按键,在电击前预测样品的电阻,在实验前，在电击杯里加入样品后放入,ShockPod,电击槽内，在,Resistance Measurement,的菜单下按下“回车键”,30,9.仪器的测量功能该功能使用户可以在日常的工作中经常对GP,10.用户可对,GPX,设置的参数,用户可设置时钟，这样可对实验的程序按日期排序，方便日后的调用,调节,LCD,屏幕的亮度,可调节在仪器进入睡眠状态的时间,31,10.用户可对GPX设置的参数用户可设置时钟，这样可对实验,特点:,ShockPod,电击槽,独特的设计,单手即可操作，使用方便,提高了处理样品的通量,安全的联锁设计，确保电击槽在开盖的情况下发出脉冲,电击杯槽的设计确保电击杯正确的放置位置,非常容易清洁,32,特点:ShockPod电击槽独特的设计32,