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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Enzymes for Molecular Cloning,酶,几乎所有的生物都能合成自身所需要的酶，包括许多病毒。,酶参与所有生命活动过程，其在细胞内的分布、含量、活性等随生物生长、发育及外界条件的改变而改变。,Ribozyme,：,具有催化能力的,RNA。,酶不都是蛋白质。,定义：,由活细胞产生，能在体外和体内起同样催化的一类具有特殊空间结构的生物大分子，包括,蛋白质和核酸,等。,用于基因克隆的酶,ER,连接酶,DNA,聚合酶:,Klenow,酶、,Taq,酶、反转录酶、,末端转移酶,碱性磷酸酶,多核苷酸激酶,核酸酶,RE,如果在细菌中没有发现,ER，,现代生物学和重组,DNA,就不可能发展起来。,Restriction,Endonuclease,definition:,molecular knives,Hundreds known,commercially available.,function:,R-M defense mechanism against foreign DNA.prevent invasion by foreign DNA such as viral DNA,by cutting it up.,修饰酶又称甲基化酶。,三大类,I,：,最早发现,3,个亚基：,HsdS,识别特定,DNA,序列,HsdM,-,甲基化,HsdR,-,限制性内切酶功能,三个亚基组成复合体，全酶才有活性。,biochemistry：,need ATP,Mg,+,SAM,cutting,：,long sequences(1000-5000nt),at,random,unspecial,cant be used in genetic engineering,III：,2,个亚基,组成：,HsdM,、,HsdR,需要,SAM、ATP、Mg2+,类似于,I,应用同样受限制,II:,应用最广,酶最简单(,Mg2+),不需要特殊条件,HsdM,和,HsdR,亚单位,切割特异,derivation,：,first three names from the,latin,names of the microorganism that produces them.,first letter(genus),next two letters(species),writing：,前三个字母用,斜体,，其他用,正体,表示。,如果酶存在于一种特殊菌株中，三个字母后加上菌株名称符号,名称最后部分往往包含罗马数字,表示在该特殊菌株中发现这种酶的先后次序。,recognition sequence:,cleave DNA,symmetrically,in both strands at short,palindromic,(symmetrical)recognition sequences to leave a 5-phosphate and a 3-OH.They leave,blunt,ends,or,protruding,5-or 3-termini,.,Eco,R,:,*,5G A A T T C 3,3C T T A A G 5,*,recognition sequence,enzymes,5 GTT AAC 3,Hpa,blunt end,3 CAA,TTG 5,5 G,AATTC 3,Eco,R,5,protruding end,3 CTTAA,G 5,5 A,AGCTT 3,Hin,d 5,protruding end,3 TTCGA,A 5,5 G,GATCC 3,Bam,H,5,protruding end,3 CCTAG,G 5,5 C,TGCAG 3,Pst,3,protruding end,3 GACGT,C 5,估算,ER,识别序列在,DNA,上出现的频率:,识别序列的频率=1/4,N,Sau,3A(4bp)=1/4,4,256,bp,Eco,RI,、,Pst,I,(6bp)=1/4,6,4096,Not,I,(8bp)=1/4,8,65536,(,rare cutters),仅是理论推测,Restriction digests,digestion of,plasmid,or,genomic,DNA,for analytical or preparative purposes,using commercial enzymes and buffer solutions.,All RE require Mg2+,usually at a concentration of up to 10mM,but different enzymes require different pHs,NaCl,concentrations or other solution constituents for optimum activity.,同裂酶,(,isoschizomer,),或,异源同工酶:,不同来源的限制酶可切割同一靶序列,同尾酶,(,isocaudiners,),：,来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。,远距离裂解酶,(,distant cleavage),：,识别位点与切割位置不一致,可变酶：,识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的,Subset,酶,：,一种酶的识别序列包含于另一些酶的识别序列之中,enzymes activity,1个活性单位：,在适当的反应条件下(包括温度、,pH,和离子强度等),1,h,内在50,l,容积中完全酶解1,ug,特定,DNA,底物(通常用,DNA),所需要的酶量。,星号活力,在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列。在酶的名称右上角加一个星号(*)表示,如,Eco,R,*,。,因此,只有在相当特殊的条件下,酶活才与发表的结果相符。,必须采用规范的实验步骤,坚持应用推荐的反应条件。,底物位点优势效应,酶对同一个,DNA,底物上的不同酶切位点的切割速率不同,Applications,透析到含50甘油的贮藏缓冲液,保存在,-20,。,消化,DNA,时,稀释到1-3单位/,l。,反应缓冲液可在有关书籍中查找到。,酶切反应注意事项,价格昂贵,决不能用水稀释,以免变性失活。,预先加入,除酶以外,的所有其他试剂。,取酶立即放于冰上。,分装小份避免反复冻融。,使用无菌的,新吸头,。,少加水,使体积最小,但保证酶液体积不超过总体积的,10,否则酶液中的甘油会抑制酶活性。,restriction map,DNA physical map：,a series of ER,Demonstration:,Linear or circle,application：,DNA sequencing,genome function map,gene library construction,RFLP,Methods,：,virous,ER，single or double,digestion,fragments size,DNA,Ligase,定义：,催化,DNA,上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3羟基和5磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的,DNA,裂口连接起来。,用途：,具有修复单链或双链的能力,在,DNA,重组、复制和损伤后的修复中都起关键作用。,提取：,许多原核和真核生物及病毒中。,T4 DNA,ligase,一,条多肽链(,Mr,=68000)，,还可作用于,RNA,但效率低得多,需,ATP,作辅因子。,E.,coli,DNA,ligase,Mr,=74000,作用于5,端带磷酸基团的,DNA,底物,NAD,+,可促进该催化反应,分子克隆使用不多，亦不能连接,RNA。,用途:,cDNA,第二链合成。,T4 RNA,ligase,由噬菌体编码,催化单链,DNA,或,RNA,连接,。,主要用途,是对,RNA,进行3末端标记,Ligation,of DNA fragments,in vivo,and,in vitro,in vivo：,不仅形成重组分子的效率低,而且还可能伴随着末端核苷酸的缺失。,in vitro,：,减小了,DNA,进入细胞后遭受降解危险；,粘性末端体外连接将保护原来识别序列的完整,可以控制连接时的反应条件,affecting factors,T,：,多数,内切酶,产生的粘性末端的,Tm,值在15以下,然而保持,连接酶,活性的最适温度却是37,因此最适温度是粘性末端的,Tm,值和连接酶最适温度的折衷。经常采用12.5（4-15）。,DNA concentrations：,外源片段浓度比载体,DNA,浓度高10-20倍,防止环化：,碱性磷酸酶预先处理质粒载体,time：,O/N better,polymerase,催化核酸体外合成反应,DNA,polymerase,依赖,于,DNA,的,DNA,聚合酶:,DNA,聚合酶(全酶);,DNA,聚合酶大片段,(,klenow,片段);,耐热,DNA,聚合酶,(,Taq,酶),依赖于,RNA,的,DNA,聚合酶,:,反转录酶。,不依赖于,DNA,的,DNA,聚合酶:,末端转移酶。,RNA,polymerase,催化,RNA,体外合成反应,依赖,DNA,的,RNA,聚合酶,不依赖,DNA,的,RNA,聚合酶,nuclease,以核酸为底物的水解酶,按底物专一性分：,RNase,、,DNase,、,非专一性核酸酶,按作用位点分：,内切,或外切酶,5,-核酸酶或3,-核酸酶,常用:,BAL31,核酸酶、,S1,核酸酶、绿豆核酸酶、,RNaseA,RNaseT1、,DNase,、,外切核酸酶、,噬菌体,外切核酸酶等。,许多核酸酶兼有内切和外切活性,核酸酶的分类,内切酶,非专一性,外切酶,3-核酸酶,核酸酶 内切酶,5-核酸酶,RNA,外切酶,专一性 非限制性,内切酶,限制性,DNA,外切酶,Kinase,激酶:,对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。,用途：,放射性标记,DNA,链的5,末端，,探针标记,Maxam,-Gilbert,化学法的,DNA,序列分析,；使缺少5磷酸的,DNA,片段和合成接头磷酸化。,该酶很难纯化,酶制品经常不纯。,铵离子是该酶的强烈抑制剂,处理前,DNA,不能溶解于含铵盐的缓冲液中。,低浓度的磷酸也可抑制该酶活性。,磷酸酶：,去除核酸末端磷酸基团的酶。,细菌碱性磷酸酶,(,BAP)：,E.,coli,中分离,牛小肠碱性磷酸酶,(,CIP),：,牛肠道分离，切除,DNA、RNA、,rNTP,和,dNTP,上的5磷酸基团,从,DNA,片段上除去5磷酸以防自身连接。,BAP,活性更高,对热和去污剂抗性更强,因此脱磷酸化后很难完全抑制,BAP,活性。,除去,CIP,可用蛋白酶,K,降解,
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