生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应

生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第1页,主要内容,绪论,试验室普通规则及试验室安全,试验汇报撰写及试验成绩评定,本学期试验内容及安排,试验一 蛋白质沉淀、变性反应,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第2页,3,生物化学试验室规则（,1,）,1,、恪守纪律，不得无故迟到、早退、大声谈笑。,2,、预习，熟悉试验目标、原理、步骤。,3,、严格听从老师指导，及时统计试验原始数据。,4,、试验场所整齐、公用试剂用后放回原位，试验完成，清洗试验器皿、收拾台面，方可离开。,5,、注意节约试剂，预防损坏仪器。使用珍贵仪器时，严格恪守操作规程，发觉故障，马上汇报老师，不得私自检修。,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第3页,4,生物化学试验室规则（,2,）,6,、,乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，远离火源操作及放置。,7,、全部废液、废弃物等，均搜集在指定容器内，不得倒在水槽内或处处乱仍。强酸和强碱不能直接倒在水槽中，应先稀释，然后倒入水槽，再用大量自来水冲洗水槽及下水道。,8,、室内禁止吸烟！煤气、水管用完即关。,Long hair should be tied back to avoid burns.In addition,avoid wearing loose articles of clothing such as ties or dangling jewelry that may come into contact with laboratory surfaces.,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第4页,5,试验室安全,-,安全用电,使用电学仪器时，要注意电压、电流是否符合仪器要求，必要时需使用稳压设备。,严格按照电器使用规程操作，不能随意拆卸，摆弄电器。,严防触电。绝不可用湿手或眼睛旁视时开电闸和电器开关。检验电器设备是否漏电时，应使用试电笔。凡是漏电仪器一律不能使用。,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第5页,6,试验室安全,-,预防火灾,起火原因：有电流短路，不安全地使用电炉、煤气灯和易燃易爆药品着火。,试验必须配置一定数量消防器材，请按消防要求保管使用，最主要是每个试验者都应有试验室安全观念，时刻保持警觉。,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第6页,7,试验室内禁止贮存大量易燃物,(,如乙醚、丙酮、乙醇，苯等,),。,必须存放少许即将使用易燃物，也应将它放在远离火源处，火焰熄灭后才可大量倾倒这些液体。,低沸点有机溶剂不准在火焰上直接加热，只能利用带回流冷凝管装置在水浴上加热或蒸馏,。,试验室安全,-,预防火灾,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第7页,8,试验室安全,-,预防火灾,.03.13,东南大学,.03.28,兰州理工大学,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第8页,9,名称,沸点,/,闪点,/,自燃点,/,乙醚,34.5,40,180,丙酮,56,17,538,二硫化碳,46,30,100,苯,80,11,乙醇,78,12,400,闪点：液体表面蒸汽和空气混合物在遇明火或火花时着火最低温度。,自燃点：液体蒸汽在空气中自燃时温度。,常见有机溶剂易燃性,不能放冰箱中储存！不能在火源附近储存、操作！,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第9页,10,易燃物蒸汽在空气中爆炸极限,名称,爆炸极限,(,体积百分数,),乙醚,1.9,36.5,丙酮,2.6,13,乙醇,3.3,19,氢气,4.1,74.2,甲醇,6.7,36.5,乙炔,3,82,试验室内禁止贮存大量易燃物！,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第10页,11,试验室安全,-,严防中毒,化学试剂有相对无毒、中度毒性和剧毒之分，在处理剧毒药品时要尤其慎重、小心。国际上常见一些标志标示不一样毒型化学药品。,使用毒性物质和致癌物必须依据试剂瓶上标签说明严格操作，安全称量、转移和保管。操作戴手套，必要时戴口罩或防毒面具，并在通风橱中进行。沾过毒性、致癌物容器应单独清洗、处理。,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第11页,12,试验室安全,-,严防中毒,水银温度计、气量计等汞金属设备破损时必须马上采取办法回收汞，并在污染处撒上一层硫磺粉以防汞蒸气中毒，,注意室内通风。,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第12页,2024/11/15,13,警告标志,有辐射性,安全布告,生物危险品,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第13页,2024/11/15,14,高度可燃,爆炸性,危险化学药品标志,有毒,腐蚀性,刺激性有害,有氧化作用,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第14页,2024/11/15,15,氯化钠,优级纯,化学药品质量标签,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第15页,2024/11/15,16,氯化钠,分析纯,化学药品质量标签,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第16页,2024/11/15,17,氯化钠,化学纯,化学药品质量标签,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第17页,18,试验室安全,-,防止烧伤和创伤,使用玻璃、金属器材时注意预防割伤及机械创伤。如发生意外，找试验室工作人员,(,少许急用药品备用,),。,浓酸、浓碱腐蚀性很强，必须极为小心地操作。用吸量管量取这些试剂,(,包含有毒物,),时，必须使用橡皮球，绝对不能用口吸收。,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第18页,19,试验室安全,-,预防生物危害,微生物、动物组织、细胞培养物、血液和分泌物 都可能存在细菌和病毒感染潜在危害，处理生物材料必需小心慎重，做完试验必须用肥皂、洗涤剂或消毒液洗手。,被污染物品，必须进行高压消毒或烧成灰烬。,被污染玻璃用具应在清洗和高压消毒前马上浸泡在适当消毒液中。,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第19页,20,试验室抢救,1,机械损伤：马上止血，到医院诊治。,强碱：先用大量自来水冲洗，再用,5%,硼酸溶液或,2%,乙酸溶液涂洗。,强酸：大量自来水冲洗，再以,5%,碳酸氢钠溶液洗涤。,酚：用酒精洗涤。,煤气中毒：马上到室外，严重者就医。,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第20页,21,试验室抢救,2,玻璃割伤：检验伤口内有没有玻璃碎片，硼酸水洗净，,涂擦碘酒或红汞水，必要时用纱布包扎。,烫伤：浓酒精消毒，涂上苦味酸软膏。,触电：关闭电源 用干木棍使电线与被害者分开。,着火,：,汽油、乙醚等有机溶剂：石棉布、沙土,电线：切断电源或用四氯化碳灭火器,衣服：勿奔走，湿衣包裹或躺地滚动,。,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第21页,22,试验汇报撰写,试验汇报分为以下几个别：,原理,试验步骤,结果与讨论,问答,试验成绩评定：,试验汇报,平时操作、表现,姓名，班级，学号，课室，试验时间、,试验老师,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第22页,试验内容及安排,(,72,课时,),1,、,绪论、蛋白质沉淀、变性反应,9,月,26-27,2,、,蛋白,质,浓度测定考马斯亮蓝法,10,月,10-11,3,、,阳离子交换树脂层析分离氨基酸,10,月,17-18,4,、,血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳,10,月,24-25,5,、,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白,10,月,3,1-11,月,1,6,、,影响酶促反应速度原因,最适,pH,、,激活剂,（,抑制剂,）,11,月,7,-8,7,、,脂肪酶活性测定,11,月,1,4-15,8,、过氧化氢酶米氏常数测定,11,月,2,1-22,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第23页,试验内容及安排,（续）,9,、糖定量测定,11,月,28-29,10,、,维生素,C,定量测定,12,月,5,-6,11,、,脂肪酸,B,氧化作用,12,月,1,2-13,12,、转氨基作用,12,月,1,9-20,13,、,鱼类,DNA,提取,12,月,26-27,14,、,核酸浓度测定,UV,吸收法,1,月,2-3,15,、,聚合酶链式反应（,PCR,）,1,月,2-3,16,、,DNA,琼脂糖凝胶电泳,1,月,9,-10,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第24页,一、试验目标,1,、了解蛋白质一些理化性质，认识蛋白质,可逆反应和不可逆反应。,2,、,了解蛋白质沉淀反应、变性作用和凝固作用,原理及它们相互关系。,试验一 蛋白质沉淀、变性反应,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第25页,蛋白质,是由,氨基酸组成大分子化合物,其,分子量颇大，介于一万到百万之间,，是一个,亲水胶体,。,蛋白质,分子,表面,亲水基团,（,-OH,-COOH,-NH,3,以及肽键）等，在水溶液中能与水分子起水化作用（,Hydration,），使蛋白质分子表面形成一个,水化层,。每克蛋白质分子能结合,0.3-0.5,克水。,蛋白质分子表面上可解离基团，在适当,PH,条件下，都带有相同净电荷，与其周围反离子组成稳定,双电层,。,二、试验原理,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第26页,因为蛋白质溶液含有,水化层和双电层,两方面稳定原因，所以胶体系统是相当稳定。,在一定物理化学原因,(,如盐析、重金属离子、有机酸、无机酸和加热,),影响下,蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质沉淀反应。这种反应可分为两种类型：,1,、可逆沉淀反应：蛋白质分子内部结构并未发生显著改变，基础保持,原有性质，沉淀原因除去后，能溶于原来溶剂中。,2,、不可逆沉淀反应：蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，,失去原来天然性质。,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第27页,蛋白质溶液沉淀,稳定是相正确，有条件,。,假如条件发生改变，破坏了蛋白质溶液稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来,。,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第28页,蛋白质分子表面,水化层,双电层,稳定亲水胶,脱水，失去电荷,沉淀反应,可逆沉淀反应,（不变性沉淀反应）,如：盐析作用,不可逆沉淀反应,（变性沉淀反应）,如：重金属盐沉淀作用,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第29页,蛋白质沉淀变性常见方法,常见方法,原理,常见试剂,实用,盐析,破坏蛋白质胶体溶液水化层和电荷层,(NH,4,),2,S0,4,、,Na,2,S0,4,、,Na,3,P0,4,、,NaCl,、,MgS0,4,常见此法来分离和纯化蛋白质。,有机试剂盐析,脱水作用；降低水介电常数和蛋白质溶解度；蛋白质析出,乙醇、丙酮、甲醇,低温乙醇提取血液中蛋白质组分,强酸、强碱沉淀,破坏蛋白质分子结构发生蛋白质变性,盐酸,硫酸,硝酸、氢氧化钠,灭活病毒,加热,变性,鸡蛋、肉类等加工,重金属盐沉淀,变性；生成不溶性盐,Ag+,，,Hg2+,，,Cu2+,和,Pb2+,临床上常见蛋清或牛乳解救误服重金属盐病人,有机酸沉淀,生成不溶性盐,苦味酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水杨酸等生物碱试剂,沉淀蛋白滤液等,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第30页,三、试验材料及设备,蛋白质溶液：,取,10ml,鲜鸡蛋清，用蒸馏水稀释至,100ml,，搅拌后用,4-8,层纱布过滤，新鲜配制。,蛋白质氯化钠溶液：,取,20ml,蛋清，加蒸馏水,200ml,和饱和氯化钠溶液,l00ml,，充分搅匀后用,4-8,层纱布滤去不溶物（加氯化钠目标是溶解球蛋白）。,1,.,材料,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第31页,2,.,试剂,3%,硝酸银，,0.5%,乙酸铅，,10%,三氯乙酸溶液，饱和硫酸铵溶液，,10%,氢氧化钠溶液，浓盐酸，浓硫酸，浓硝酸，,5%,磺基水杨酸，,0.1%,硫酸铜，饱和硫酸铜溶液，,0.1%,乙酸，,10%,乙酸，饱和氯化钠溶液，硫酸铵粉。,3,.,器材,水浴锅,漏斗,滤纸,吸管,试管及试管架,量筒等。,生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应,第32页,四、试验内容,1.,蛋白质可逆反应,蛋白质盐析,步骤,现象,解释结论,取一支试管，加入3mL蛋白质氯化钠溶液和等量饱和硫酸铵溶液，混匀，静置10分钟,观察有没有蛋白质（球蛋白）沉淀,过滤后，向滤液中加入,硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌,，直至粉末不再溶解，直至饱和,观察有没有沉淀（