细胞培养无菌操作技术课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 基本培养技术,第三章 基本培养技术,1,第一节 无菌操作的基本技术,第一节 无菌操作的基本技术,2,防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的无菌。,细胞培养无菌操作基本技术分三个部分：工作环境及表面的处理，细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理及培养液与培养细胞的处理。,防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由于体外,3,一、工作环境的处理,(一)培养前准备,为了做好培养前准备工作，宜制定出分门别类的操作卡片，如“分装血清”、“组织块贴壁初代培养”、“传代培养”、等等。各卡片上记有需用器材和物品名称、要求及数量等，实验者可按卡片收集所用物品，清点无误后，把用品放置于操作场地，然后进行消毒，可避免操作开始后，因物品不全在往返拿取时增加污染机会。,一、工作环境的处理,4,1操作野消毒：现多用紫外线灯灭菌，效果很好。用30 瓦紫外线管灯，操作箱消毒20 一30 分钟即可；操作室空间大，需消毒3050 分钟。净化工作台亦可设紫外线灯，主要用于消毒台面上用品，但对台面流动的空气无意义。在用紫外线灯照射期间，在操作台面上勿置培养细胞和培养用液等物，以免受射线影响(必要时可用纸张覆盖)。紫外线只有直接杀菌作用，工作野用品过多或重叠放置，物品相互遮挡射线，会降低消毒效果。,1操作野消毒：现多用紫外线灯灭菌，效果很好。用30 瓦紫外,5,2洗手和着装：原则上和外科手术相同。在利用无菌箱工作时，因整个前臂要伸入箱内，洗刷时一定要清洗到肘部。可用软塑料瓶内盛75酒精，瓶口插一弯管，右手捏出三五毫升入左手内，进行擦洗消毒极为简便；必要时亦可用0.2的新洁尔灭洗涤消毒。进行培养工作时，如利用净化台，仅戴口罩和工作帽，着一般工作服即可。在无菌室内工作需着消毒衣帽。,2洗手和着装：原则上和外科手术相同。在利用无菌箱工作时，因,6,3火焰消毒：在无菌环境进行无菌操作时首先要点燃酒精灯,以后操作如安装吸管帽、启开或封闭瓶口等，都需经过火焰烧灼进行。已吸取过营养液的吸管不能再用火焰烧灼，因吸管头中残留营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入培养液中。消毒火焰要求无色或微蓝色，而红黄色或发黑的火苗，表示燃烧不完全或含有杂质，有害物能混入培养液内。因此酒精灯需用96的不含杂质的酒精，绝不能含有二甲苯和甲醇。,3火焰消毒：在无菌环境进行无菌操作时首先要点燃酒精灯,以后,7,(二)培养操作,进行培养操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒触及部，如不便消毒时，应取备品更换。为便于拿送用品，工作台面上的用品要有合理的布局.,(二)培养操作,8,原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在末做处理之前，勿过早暴露在空气中。培养液在末用前，不要过早开瓶；用后如不再重复使用，应立即封口。培养用瓶开瓶以后，应保持45 度斜位或平放，开口向上长时间直立可增加落菌机会。吸取各种用液时均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。,原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置,9,(三)实验结束后，将实验物品带出工作台。如需要继续进行下一个实验，则用70%酒精擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风机运转10 分钟后，才可进行下一个实验操作。,无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞，必要物品，如试管架、移液器或吸管头等可以暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出，以利气体流通。,(三)实验结束后，将实验物品带出工作台。如需要继续进行下一个,10,（一）清洗,在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长,微生物产品附带杂物,上次细胞残留物,非营养成分的化学物质,需要清洗的培养用品,玻璃器皿的清洗,胶塞的清洗,塑料制品的清洗,二、细胞培养所用器皿的清洗与消毒,（一）清洗在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,11,1、玻璃器皿的清洗,包括,浸泡、刷洗、浸酸,和,冲洗,四个步骤,清洗后的玻璃器皿,干净透明无油迹,不能残留任何物质,1、玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤,12,浸泡,：,初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉,新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等,先用自来水简单刷洗，然后用,5,稀盐酸液浸泡过夜，中和其中的碱性物质,浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附,13,再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉,用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上,细胞培养无菌操作技术课件,14,刷洗：,用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质,刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度,刷洗：,15,浸酸,：,玻璃器皿浸泡到清洁液中,清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质,浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面,浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时,清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）,强清洁液 631000200,次强清洗液 120 2001000,弱清洁液 100 1001000,浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中,16,配制时可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。,配时切记，不能把水加于硫酸内（将因硫酸遇水瞬间产生大量的热量使水沸腾，体积膨胀而发生爆溅）。,洗液对皮肤、衣物等均有腐蚀作用，故应妥善保存。,配制及使用时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分,配制时可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃,17,配成后清洁液一般为棕红色，,若使用的次数过多，重铬酸钾就被还原为绿色的铬酸盐，效力减小，此时可加热浓缩或补加重铬酸钾，仍可继续使用。为防止吸收空气中的水分而变质，洗液贮存时应加盖。,附有蛋白质类或血液较多的玻皿，切勿用洗液，因易使其凝固。,配成后清洁液一般为棕红色，若使用的次数过多，重铬酸钾就被还原,18,冲洗,在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹,最好用洗涤装置,如用手工操作,需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，蒸馏水浸泡过夜，自来水冲洗5遍，一蒸水5遍，二蒸水3遍，培养瓶要求二蒸水也用流水，烤干备用,冲洗,19,2、胶塞的清洗,新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理,常规清洗方法,每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用,2、胶塞的清洗新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水,20,3、塑料制品的清洗,塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。,塑料制品现多采用,无毒,并已特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品,清洗,程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（1520,遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。,3、塑料制品的清洗塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力,21,物理消毒法,紫外线消毒,高温湿热灭菌,高温干热消毒,过滤除菌,化学消毒：,抗生素消毒,（二）消毒,物理消毒法（二）消毒,22,1、紫外线消毒,可杀死多种微生物。革兰阴性菌最敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。,无菌操作台用前和用后2-3小时或过夜。,塑料器皿消毒过夜。,（二）消毒,1、紫外线消毒（二）消毒,23,紫外灯的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，离地面2米的30W灯每天照射23小时，灯管离地面2米以外要延长照射时间，2.5米照射效果较差。紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5米，照射时间30分钟为宜。,紫外线的穿透能力非常弱的，主要靠电离产生氧自由基来消毒。细胞培养室里面一些不能照射紫外的物件可以用一般的材料盖住。,紫外灯的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，离地面,24,不要担心紫外不能照射到的角落，因为紫外杀菌功能除了紫外本身以外，还可以由产生的臭氧来完成。臭氧过量吸入的作用应该和双氧水的作用是一样的，个人认为也许有一定的致癌性。所以紫外灭菌以后，最好过一个小时再进去。,注意事项：,不要开着紫外等操作,紫外线灯管要保持清洁透亮,定期监测消毒效果。,细胞培养无菌操作技术课件,25,2、,高温湿热灭菌:,高压蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、金属器皿、橡胶制品和某些培养液都可以用这方法灭菌。培养用液、橡胶制品10磅10分钟。玻璃、金属15磅20分钟。,煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、使用方便等特点。,2、高温湿热灭菌:,26,3、高温干热消毒,160以上90120分钟可以杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。,主要用于灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿及不能与蒸汽接触的物品。,3、高温干热消毒,27,注意事项：,干热灭菌后要使物品逐渐冷却后再打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。,干烤箱内物品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。,烧灼也是灭菌方法之一，常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。,注意事项：,28,4、过滤除菌,将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。,大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。适用于培养基、血清、酶、抗生素等消毒。,微孔滤膜滤器除菌的关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。滤膜滤器有多种规格。一般在要求孔径在0.3um以下。,4、过滤除菌,29,4、化学消毒,70%酒精、新洁而灭可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。,乳酸蒸汽消毒可对室内空气消毒,5、抗生素消毒,抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。,4、化学消毒,30,可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有一定的适应范围。如常用的过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气；多用新洁而灭消毒实验室地面；常用干热、湿热消毒、消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿；采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液。,可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有,31,