流式细胞检测ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,中新口腔,中新口腔,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,中新口腔,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,王丽,2015-07-07,流式细胞技术,FLOW CYTOMETRY,王丽流式细胞技术,What does it mean,?,CYTO,Cell,Measure(ment),MEASUREMENT OF A CELL,METRY,2,FLOW CYTOMETRY,：,在液流系统中，快速测定单个细胞或微粒的,物理特性,和,生化特性,的方法,。,Flow Cytometer(FCM),流式细胞仪,Flow Sorter,流式细胞分选仪,What does it mean?CYTOCellMeas,BD FACSVantage,BD Calibur,流式细胞仪,BD,流式细胞仪液流系统,3,BECKMAN,CytoFLEX,Miltenyi MACSQuant,Guava 5HT,微毛细管细胞分析仪,BD FACSVantageBD Calibur 流式细胞仪,流式细胞仪的组成,Optics,Electronics,Software,Fluidics,Waste,4,流式细胞仪的组成OpticsElectronicsSoft,样品规格：,96,孔板 或,1.5 mL,小管,5,进样准备,样品规格：96孔板 或 1.5 mL 小管5进样准备,工作流程,样本制备,荧光染色,上样检测,数据分析,Fluorescence,Detector,Histogram,Single Cell Suspension,Cell,Suspension,Fluorescently,Labelled,Antibody,Fluorescence,Y,+,Blue Laser(488 nm),6,工作流程样本制备FluorescenceHistogramS,液流系统,功能：传送待测样本中的细胞到激光照射区。,样本：0.2-150微米的粒子，最快可在,1,秒种内计测数万个细胞。,Sheath Fluid:10 mL/Test,Waste,：,1L/hr run,10,万,100,万,cells/Test,No Sheath Fluid,Waste,：,500 nm,SP 500=PE PerCP FITC,PE,较强，适用于弱表达抗原,FITC,最便宜，适用于强表达抗原,21,常见荧光素：抗体的选择：21,常见荧光物质的应用,PM1(Orange),Add nm,PM2(Red),PM3(Green),Fluorophores Conjugated to an Ab,PE,PE-Cy5,FITC,Dead Cell Dyes(DNA staining),PI,7-AAD,Live Cell Dye,(DNA Staining),LDS751,Fluorescent Proteins,GFP,Cell Tracking Dyes,CFSE,常见荧光物质的应用PM1(Orange)PM2(Red),直方图和点阵图,直方图,(Histogram Plot),单参数分析,.,X-Axis:,荧光信号强度,.,Y-Axis:,细胞数目,.,点阵图,(Dot Plot),双参数分析,.,X and Y axis,：两种荧光信号强度,.,每个点代表一个细胞,.,Log&,Lin:,荧光强度的坐标可以是线性的，也可以是对数的,.,直方图和点阵图直方图(Histogram Plot)点阵图(,直方图：可根据单一因素区分细胞亚群,10e0,10e1,10e2,10e3,10e4,CD20-FITC(GRN-HLog),70,53,35,18,0,Count,M2,M1,10e0,10e1,10e2,10e3,10e4,CD20-FITC(GRN-HLog),70,53,35,18,0,Count,70 cells each have a green fluorescence intensity of about 400,Notice the subpopulation?,直方图：可根据单一因素区分细胞亚群10e010e110e21,25,血细胞分群,（红细胞溶解后）,点阵图：根据多因素区分细胞亚群,25血细胞分群（红细胞溶解后）点阵图：根据多因素区分细胞亚,荧光补偿,光谱重叠的校正,：,目前使用的荧光染料都是宽波谱，两两之间的发射谱范围有一定的重叠。为了克服这种误差，可使用荧光补偿电路，设置合理的荧光信号补偿。,荧光补偿光谱重叠的校正：,我需要准备什么？,1.Why,：为什么进行流式细胞检测？,流式细胞技术是否是最佳的检测方法？,检测的原理是什么？,要检测的物质是什么？,2.Where,：荧光标记的物质在哪里？,是否需要对细胞进行固定？打孔？,3.Which,：选择什么荧光标记物？,4.How:,样品制备流程，多少个标本？（空白对照、阴性对照,）,5.When:,预约（,175874947,群共享下载申请表）,Do it,！,（合适的细胞密度并避免细胞结团）,27,我需要准备什么？1.Why：为什么进行流式细胞检测？,28,应用,范围,细胞绝对计数和活力分析,细胞增殖,细胞周期,细胞凋亡,细胞毒实验,抗,原,定量检测,线粒体膜电位检测,28应用范围细胞绝对计数和活力分析,实验对照的设计,空白对照,ALL,：,采用不标记的细胞进行平行测定，用于确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功。,阴性对照：,调节各荧光探测器合适的放大倍数，即确定待测标本的基础荧光域值。,常用同型对照（与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同亚型的免疫球蛋白），用于消除抗体与细胞非特异性结合产生的背景。,阳性对照：,用已知表达某种抗原的细胞（阳性细胞）进行平行实验，通常用于检测抗体是否正常或确定实验方法的稳定性和准确性。,补偿对照：,多色分析时，将用于多色标记的各种荧光抗体分别与样本进行单色标记，以测定荧光信号的光谱重叠情况以进行调节。,单色分析：,设同型抗体对照,多色分析：,同型对照，补偿对照,29,实验对照的设计空白对照 ALL：采用不标记的细胞进行平行测,细胞周期：,从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止，为一个细胞周期。（细胞内的,DNA,含量随细胞周期进程发生周期性变化。）,DNA,含量：,G1,（,DNA,合成前期，,2C,）、,分裂间期,S,（,DNA,合成期，,2C-4C,）、,G2,（,DNA,合成后期，,4C,）,分裂期,M,期（,DNA,为,4C,）。,利用核酸标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内,DNA,的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。但是分裂期（,M,期）的前期、中期、后期、末期四个时期，普通流式无法进行定量检测。,30,1.DNA,细胞周期分析,应用实例,细胞周期：从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止，为一,1.DNA,细胞周期分析,31,1.DNA细胞周期分析31,实验步骤及注意事项：,1,、细胞周期固定：,加,200ul,细胞（贴壁培养的细胞需要先用胰酶消化）到,1.5ml,离心管中,300g,转速离心,5min,，并用,1PBS,清洗一次离心去上清 添加,300ul PBS,溶解沉淀细胞,缓慢加入,20,预冷的,100%,乙醇,700ul,固定细胞（固定过程中需要,边滴加乙醇，边震荡,，不要产生细胞聚团，否则会严重影响实验结果）最后乙醇终浓度为,70%,20,孵育至少,3,小时（建议,4,孵育过夜，效果会更好）,。,2,、将固定好的细胞,300g,转速离心,5min,，并用,1PBS,清洗一次。将细胞用,200ul,的,Guava,细胞周期试剂重新悬浮，室温孵育,30min,，注意避光。,3,、,用,200,目细胞筛过滤细胞（如果使用,PI,染色必须过滤），显微镜下细胞无结团，,Guava,流式细胞仪检测。,32,1.DNA,细胞周期分析,实验步骤及注意事项：1、细胞周期固定：321.DNA细胞周,2.,早期细胞凋亡检测,33,2.早期细胞凋亡检测33,2.,早期细胞凋亡检测结果,34,正常细胞：,Annexin V(-)/7-AAD(-),早期凋亡细胞：,Annexin V(+)/7-AAD(-),晚期凋亡细胞：,Annexin V(+)/7-AAD(+),CD95/FASL,刺激诱导凋亡,2.早期细胞凋亡检测结果34正常细胞：Annexin,实验步骤,1.,样本准备,(,贴壁细胞,),：弃去培养细胞,(,对数生长期,),中的旧培养液，加入胰酶消化细胞，。,收集旧培养基，通过离心获得凋亡或死亡细胞，与之后消化后的细胞混合，再检测,。,2.,细胞染色：在,96-well,微孔板相应的孔中加入,100ulGuava Nexin,（货号：,4500-0450,）和,100ul,准备好的细胞悬液，室温避光孵育,20min,；尽快用流式细胞仪获取结果（,1h,内）。,流式细胞仪检测获取数据。,注意：实验最好包括实验组、阴性对照和阳性对照（凋亡诱导组）,。,35,2.,早期细胞凋亡检测结果,实验步骤 1.样本准备(贴壁细胞)：弃去培养细胞(对,细胞凋亡,细胞凋亡是动态事件，在不同时期展现不同的凋亡信号。,早期,磷脂酰丝氨酸（,Phosphatidylserine,，,PS,）暴露在细胞膜上，与,PS,结合的,Annexin V,成为检测凋亡早期的最常用指标。除此之外，线粒体膜电位变化和细胞色素,C,的释放，也被认为是凋亡的早期信号。,中期,Caspase,家族蛋白分布于各条凋亡通路上，是中期凋亡的指标。活化,Caspase,蛋白检测可以使用,FLICA,底物。,晚期,DNA,片段化是凋亡晚期的显著特征。通过,TUNEL,法对断裂的,DNA,片段进行标记。,36,细胞凋亡细胞凋亡是动态事件，在不同时期展现不同的凋亡信号。3,凋亡的途径,Caspase-8,外源性,TNF-alpha/FAS,受体,Response to environmental cues,Caspase-9,内源性,细胞色素,C,的释放,DNA,损伤或细胞周期阻滞,Caspase-3/7,关键的执行蛋白,MultiCaspase,caspases 1,3,4,5,6,7,8&9,的检测,Caspase,家族蛋白酶是细胞程序性死亡过程中心点。,凋亡的途径Caspase-8 外源性Caspase-9 内源,Guava Incyte IC50/EC50 自动分析,IC50,即半数抑制浓度，是指一种药物能将细胞生长、病毒复制等抑制,50%,所需的浓度。,EC50,即半数效应浓度，是指引起受试对象,50%,个体产生一种特定效应的药物剂量。,使用,Guava Incyte,软件，可以自动进行,IC50/EC50,计算和曲线绘制。,38,Guava Incyte IC50/EC50 自动分析IC5,39,抗体表达,多样本单指标检测,39抗体表达多样本单指标检测,40,+,抗体表达,多指标检测,40+抗体表达多指标检测,41,Thank you,！,41Thank you！,