实验二PCR引物设计课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PCR引物设计,实验内容,PCR 引物设计要点,Primer Premier 软件设计引物,ncbi 在线 primer-Blast 获取候选引物,引物对的特异性验证,PCR反应一般由三个步骤组成：模板的热变性；引物复性到单链模板上；热稳定DNA聚合酶催化的延伸,一、引物设计要点,1.碱基组成：,GC含量应在40%-60%（45%-55%）之间；,4种碱基在引物中分配均匀；,没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等；,没有二核苷酸重复序列，如GCGCGC等；,2.引物长度：,引物中与模板互补的区应为18-27个核苷酸长度；,上下引物长度差别不能大于3bp，如上游引物为19bp，下游引物为24bp等。,3.解链温度（Tm 值）：,引物的 Tm 值一般为50-70；,计算出来的两个引物的 Tm 值相差不能大于5；,扩增产物的 Tm 值与引物的 Tm 值相差不能大于10；,这些特性保证了扩增产物在每一个 PCR 循环可有效变性。,4.重复或自身互补序列：,形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。,5.上下引物的互补性：,一个引物的3末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。,6.3末端,3末端的性质非常关键。,不推荐3末端有.NNNCG或.NNNGC序列的引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生；,5端序列添加限制性酶切位点。,二、Primer Premier 软件设计引物,是由加拿大的 Premier 公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件,主要界面分为序列编辑窗口（genetank）、primer design、酶切分析（restriction site）和 Motif,正向（As is）、反向（reversed）、互补（complemented）及反向互补（reverse complemented）。,Primer,点击 Search，进行引物搜索,Search criteria 窗口：多种参数可以调整。,Primer Length常设置在1830bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。,PCR Product size最好是100500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。,ManualSearch parameters 人工搜索参数设置窗口。,Search stringency应选High。,GC含量一般是4060。,其它参数默认就可以。,Search progress 窗口中显示Search CompletedOK键,结果窗口有三种显示形式，上游引物、下游引物和成对显示。引物按优劣次序排列，满分为100。选其中的一对引物，在主窗口显示结果。,对于上述引物，如果其它各项指标还可以，可在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。,当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它。,引物3端2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。,该图分为四部分：最上面是图示模板及产物位置，“S”和“A”可查看有义链或反义链的引物。右边是两个引物在模板上结合位置的直观图；第二层是模板及引物序列的配对情况；第三层显示引物的各种参数。注意：尾末给出该引物的最佳退火温度！第四层：四种重要指标的分析,Ta：复性温度（退火温度），至关重要！,退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率会非常低；,退火温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性DNA片段的扩增；,退火温度，通常比理论设计的引物和模板的Tm值低 3-5 下进行。,最好通过对复性温度比两条引物的Tm 值低 2-10 内进行PCR预实验（梯度）来对复性条件的优化。,引物长度：控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度。长的PCR引物能给扩增带来更好的特异性，可以通过降低退火温度提高反应的灵敏度，不过长引物易形成包括发夹结构二聚体自身互补等二级结构。适宜引物长度为18-27 nt。,Tm 融链温度：根据相邻二碱基对作用原理来计算融链温度。,PCR 反应的合适 Tm 范围为56-63（50-70）,GC%含量：对于PCR 反应来说 GC含量在50%左右比较合适。,（40-60%,45-55%）,Degeneracy多义性，尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，尽量避免3末端的多义性，因为这个位置即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。,三、ncbi 在线 primer-Blast 获取候选引物,点击Primer Blast,或者打开mRNA序列后，点击Pick Primer,或者,mBad基因编码序列,至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在DNA对RT-PCR的干扰。,选择物种,筛选时，上、下游引物不在同一个外显子上的引物对。,四、引物对的特异性验证：BLAST 验证引物,如果一对PCR引物能够和其他基因或目的基因的其他位置配对，可能产生非特异性的扩增产物，甚至导致目的基因的扩增失败。,通过NCBI上提供的序列相似性搜索程序，可检索到该物种中所有能够与所设计引物互补的序列，包括基因片段和基因组片段。,http:/www.ncbi.nlm.nil.gov/BLAST/,点击Basic BLAST中的 nucleotide blast 选项,在Enter Query Sequence栏中输入引物序列：,例：mouse Bad基因上游引物为5-GGGCAGCCACCAACAGTCATCAT-3,为本次搜索命名,选该物种基因组和转录物作为搜索的范围,引物长度为23nt，每条横线表明该匹配序列在引物上的位置。,与引物匹配的序列有两类：转录物和基因组序列。在通过RT-PCR时由于提取RNA的时候基因组DNA可以被完全去除，基因组DNA上潜在的引物匹配序列不会对扩增目的基因造成影响，因此只有位于转录物上的匹配序列才有可能对PCR产物产生不利影响。,目的基因,基因Tm9sf1上有16nt与引物匹配，但是引物的3端有3个碱基不能匹配的，因此不会对目的基因扩增产生影响。,如果其他基因序列与上游引物的3端有匹配，此时查看与下游引物的3端的匹配情况，如果不匹配的话，不影响目的基因扩增结果。,分析结果表明，这对引物虽在其他基因序列上有不同程度的错配，但是他们对mBad 基因扩增不会产生不利影响，属于特异性较好的引物对。,在Enter Query Sequence栏中输入引物序列：,例：引物为5-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3;,5-TGCCCATCACAACATCATCT-3,同时输入上下游引物。输入上下游引物都从5 3。输入上游引物后，加上20个字母n，再输入下游引物。,在Choose Search Set栏中：Database根据预操作基因的种属定了，可选Human genomic+transcript或Others,在Program Selection中：选择Somewhat similar sequences(blastn)项，如下图：,在此界面最下面关键要点击Algorithm parameters参数设置，进入参数设置界面。,在General Parameters中：Expect thresshold期望阈值须改为1000，大于1000也可以；在Word size的下拉框将数字改为7。,图中：序列与引物匹配的得分值小于40分、4050分、50-80分、80-200分等，分值越高，特异性越好；线段代表上或下游引物，其颜色和上面对照后就可得出该条引物的分值。两线段间没有连线的，表示单条引物与该基因一致。有连线的代表这些序列与上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并与下游引物互补（Strand=Plus/Minus），理论上可以扩增出基因片断。点击线段，就能跳转到该基因的结果信息概要。,Accession，数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息,Desscription序列的简单描述,高的就是有两线段间有连线的,代表随机匹配的可能性。E值接近零时最有意义，也就是说序列完全匹配了。,比对到的序列长度,E,值越小为好！,匹配上的碱基数占总序列长度的比例,缺失或插入，用“,-”,来表示,Query1,、,2,表示输入的两对引物，,Sbjct,表示在库里比对的序列,Primer BLAST,的详细结果,