kras和egfr检测与临床应用课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,KRAS,和,EGFR,检测与临床应用,汇报内容,KRAS和EGFR的简介及临床意义,ARMS-PCR的根本原理和技术特点,等位特异性引物设计,KRAS试剂盒开发简介,KRAS,和,EGFR,的简介及临床意义,KRAS,背景,KRAS是一种原癌基因，长约35kb，位于12号染色体，是RAS基因家族成员之一，编码的蛋白主要参与PI3K、PTEN、AKT和RAF、MEK、ERK信号通路的调控；,EGFR在通路中位于KRAS上游，配体与之结合后可以激发其酪氨酸激酶活性，导致KRAS的活化和通路中信号传导；,KRAS是许多恶性肿瘤的常见突变基因：胰腺癌65%-90%、结直肠癌40%、肺癌20%、卵巢癌15%。,KRAS,基因突变影响结直肠癌药物疗效,KRAS基因野生型的转移性结直肠癌患者能从EGF抗体西妥昔单抗、帕尼单抗治疗中获益，而基因突变的患者治疗效果很差；,KRAS,突变型患者对西妥昔单抗无应答，其总体生存期明显低于,KRAS,野生型患者,Karapetis CS,2021,N Eng J Med,结直肠癌患者检测,KRAS,突变相关指南,欧洲药品评估局EMEA，2021指出：KRAS野生型的进展期结直肠癌患者可能从帕尼单抗中受益，而突变型患者受益较少。,美国临床肿瘤学会ASCO，2021推荐：转移性结直肠癌患者应检测KRAS突变，如有KRAS12、13位突变，那么不应进行EGFR单克隆抗体治疗；,美国FDA指南推荐：在使用靶向药物西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性结肠直肠癌前必须检测KRAS基因的基因型；2021年7月6日批准第一个用于结直肠癌的基因检测Qiagen，以判断西妥昔单抗是否有效；,美国国立综合癌症网络NCCN，2021指南说：转移性结直肠癌患者均应进行RAS突变检测KRAS和NRAS，至少应检测KRAS第二外显子的突变情况。KRAS或NRAS突变型的病人不应采取西妥昔单抗或帕尼单抗治疗。,中国卫生部于2021年10月14日发表了?结直肠癌诊疗标准2021版?。明确指出在患者确定为复发或转移性结直肠癌接受西妥昔单抗、帕尼单抗时，必须检测肿瘤组织的K-ras基因状态。在晚期/转移性结直肠癌化疗中，在治疗前检测肿瘤 K-ras 基因状态，EGFR不推荐作为常规检查工程。,KRAS,基因突变影响非小细胞肺癌药物疗效,KRAS基因野生型的非小细胞肺癌患者能从小分子酪氨酸激酶抑制剂TKI，如吉非替尼、厄洛替尼治疗中获益，而基因突变的患者易发生抵抗；,KRAS突变型患者使用厄洛替尼联合化疗后，其无病症生存期和总生存期明显低于野生型患者图中红线所示,Anderson SM,2021,Expert Rev.Mol.Diagn,Eberhard DA,2005,J Clin Oncol,非小细胞肺癌患者检测,KRAS,突变相关指南,美国国立综合癌症网络NCCN，2021指出，KRAS突变与非小细胞肺癌患者TKI抵抗有关，KRAS基因测序有助于确定哪些病人适合TKI治疗。当KRAS基因发生了突变，那么不建议病人使用厄洛替尼进行分子靶向治疗。,KRAS,主要突变位点,在结直肠癌中，,KRAS,突变主要发生于,codon12(80%),、,codon13(15-20%),、,codon61,和,146(C,6239,G719S,18,2155GA,6252,G719C,18,2155GT,6253,E746-A750del(1),19,2235-2249del15,6223,E746-A750del(2),19,2236-2250del15,6225,L747-P753S,19,2240-2257del18,12370,E746-A750I,19,2235-2252AAT(complex),13551,E746-A750del,19,2235-2253del18,12728,E746-A750A,19,2237-2251 del15,12678,E746-S752A,19,2237-2254 del18,12367,E746-S752V,19,2237-2250 T(complex),12384,E746-S752D,19,2238-2255 del18,6220,L747-A750P,19,2238-2248 GC(complex),12422,L747-T751Q,19,2238-2252 GCA(complex),12419,L747-E749del,19,2239-2247del9,6218,L747-T751del,19,2239-2253del15,6254,L747-S752del,19,2239-2256del18,6255,L747-A750P,19,2239-2248TTAAGAGAAG C,12382,L747-P753Q,19,2239-2258CA(complex),12387,L747-T751S,19,2240-2251del12,6210,L747-T751del,19,2240-2254del15,12369,L747-T751P,19,2239-2251 C(complex),12383,T790M,20,2369C T,6240,S768I,20,2303GT,6241,V769-D770insASV,20,2307-2308 ins GCCAGCGTG,12376,H773-V774insH,20,2319-2320 ins CAC,12377,D770-N771insG,20,2310-2311 ins GGT,12378,L858R,21,2573TG,6224,L861Q,21,2582TA,6213,EGFR,突变与,EGFR-TKI,药物疗效关系,所在外显子,突变类型,与,EGFR-TKI,疗效关系,18,G719A(S/C)3,种点突变,药敏突变,19,19,种缺失突变,药敏突变,20,点突变,S768I,药敏突变,20,点突变,T790M,耐药突变*,20,3,种插入突变,耐药突变*,21,点突变,L858R,药敏突变,21,点突变,L861Q,药敏突变,ADx EGFR,试剂盒突变结果检测,组别,突变类型,所占比例,对吉非替尼敏感性,证据,1,Exon 19 deletions;L858R,90%,充分,2,T790M/deletion;T790M/L858R;,G719X;L861Q;S768I,7%,有限,3,T790M alone;Exon 20 insertions;,other mutations,3%,无,ARMS-PCR的根本原理和技术特点,ARMS-PCR,原理,ARMS是Amplification Refractory Mutation System(扩增阻碍突变系统)的缩写。,根据 PCR过程中要求引物和模板间的严格互补配对来实现对突变位点的检测,当引物 3 末端出现错配时,产物将不能延伸。,因此设计两条上游或下游引物，使其3末端分别与突变位点碱基匹配和错配，共用下游或上游引物，分别扩增野生型和突变型目的片断。,ARMS-PCR,原理,Two Allele-Specific(AS)primers,one for each allele of a SNP are designed.The AS primers contain one of two polymorphic nucleotides at the primer 3 end.Two sets of primers,either forward or reverse primers can be designed.If a common reverse or forward primer is used in a PCR reaction,the reaction is called allele-specific PCR(AS-PCR).,You F.M.2021,BMC Bioinformatics,PCR,产物检测,-Real time PCR,每个,PCR,循环,检测荧光信号,，,不同,PCR,产物，不同荧光信号,相比凝胶电泳：更快，可定量，无,PCR,产物污染,信号产生方法：,Scorpion(Qiagen),，双环探针,(,厦门艾德,),，,Taqman,，,Molecular beacons,，,Sybr green,，,Yo-pro,Figure 2 The sensitivity of QuanTAS-PCR for quantifying JAK2 mutant alleles.,Zapparoli G.V.2021,BMC Cancer,应用于,Real time-PCR,的,ARMS-PCR,G,C,A,T,G,A,A,G,G,allele,A,allele,5,5,5,5,3,3,3,3,AS primer,AS primer,Mismatch,Mismatch,Reverse primer,Reverse primer,FAM-5,3-BHQ1,FAM-5,3-BHQ1,Probe,Probe,ARMS,技术特点,优点：,灵敏度高0.1-1%,操作简便,周期短,不产生PCR产物污染,适用样本类型多如FFPE,精确突变类型,缺点：,方法建立需时较长,仅能检测突变,测序法与ARMS法相比较,Sanger,测序法,焦磷酸测序,ARMS,敏感度,10-20%,5-10%,1%,FFPE,标本成功率,低,较高,高,商用试剂盒,无,有,有,流程与速度,1-2,天,2-3,天,AGT,Gly13Ser,GGCAGC,Gly12Arg,GGTCGT,Gly13Arg,GGCCGC,Gly12Cys,GGTTGT,Gly13Cys,GGCTGC,Gly12Asp,GGTGAT,Gly13Asp,GGCGAC,Gly12Ala,GGTGCT,Gly13Ala,GGCGCC,Gly12Val,GGTGTT,Gly13Val,GGCGTC,三引物设计原理,You F.M.2021,BMC Bioinformatics,三引物设计,ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG,野生型引物F,5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 19nt，51,突变型引物F,5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-319nt，49,下游引物R,5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-325nt，54,三引物设计,下游引物设计,ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTG,GACGAATATGATCCAACAATAGAGG,ATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG,选择序列,：,5-,GACGAATATGATCCAACAATAGAGG-3,互补链：,3-CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC-5,下游引物：,5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3,3,端增加错配,如果3端是弱错配C/A或G/T那么需要引入强的错配A/G或C/T才可阻断3端的扩增；,如果3端是强错配A/G或C/T那么需要引入弱的错配C/A或G/T或不需引入错配