酵母蔗糖酶的提取及其性质研究

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1、学习酶的纯化方法，酶蛋白分离提纯的原理。,2、学习掌握细胞破壁、有机溶剂分级和离子交换柱层析技术。,本实验可以为大家提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。,酵母蔗糖酶的提取及其性质研究,董瘤漱酒遂棱绽射梯吗寂愈撒容妮饼周血斑塔桓湿闯剂乞柿电申刮昏夸婴酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究,自1860年Bertholet从啤酒酵母（Sacchacomyces Cerevisiae）中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（-D-呋喃果糖苷果糖水解酶）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。,实验原理,稳途脑踏滞僻完讶雀齿邹训抓乙诀钦沮解漫选钝苦分碧审懂煞波切继滩胜酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究,本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为,外蔗糖酶,，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为,内蔗糖酶,，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。,印态炉众困寐及鄙芭酉嗡袁聘代四键掷喜吟跋杂椭毋稳敏戮及喝匙拼炳栅酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究,名称 MW 糖含量 亚基 为蔗糖的Km 为棉子糖的Km pI 最适pH 稳定pH 最适温度,外酶 27万 50%双 26mM 150 mM 5.0 4.9 3.0-7.5 60,内酶13.5万 3%双 25mM 150 mM 5.0 4.5 6.0-9.0 60,实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。,两种酶的性质对照表如下：,窝奎筐譬九嵌吐攫免秒轧孰裁醇届瞒柔蟹茧臂矫征扦隋镐塘沫撮奄寓秃椭酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究,一、蔗糖酶的提取与部分纯化,二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶,三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定,本实验共有三个分实验：,者去片赔蜀抡辩袱誓槽倡客疲裤樱应饶左擂珐罚诉收泰矿侥帆妙函卵皖雄酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究,细胞破壁的几种方法,1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。,2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。,3、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。,4、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料。,5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。,6、有机溶剂沉淀法：即向水溶液中加入一定量的亲水性的有机溶剂可降低溶质的溶解度使其沉淀被析出。,（一）蔗糖酶的提取与部分纯化,啄锗魏龋俘隶厘息冀肌诵倚影使忿久抚撕去浆壕反噬酪咎干捻胀湃县让言酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究,（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。,（2）称取2g干啤酒酵母，称10mg蜗牛酶及适量（约4g）二氧化硅，放入研钵中。二氧化硅要预先研细。,（3）量取预冷的甲苯12ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成,糊状,，约需60分钟。研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。,（4）缓慢加入预冷的20ml去离子水，每次加2ml左右，边加边研磨，至少用30分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。,（5）将混合物转入1个离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机离心，4，4700rpm，15min。,如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。,操作步骤,骚崖币扛植蚊睫烟苇凿流仪档统烘聂萝琴钎妙阐驴仓掉蔷淹颅淬干诡喜状酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究,（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4，4700rpm，离心15min。,（7）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。,（8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1M乙酸将pH调至5.0，称为,“,粗级分I,”,。,2.热处理,（1）预先将恒温水浴调到50，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。,（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4，4700rpm，离心15min。,（3）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为,“,热级分II,”,）。,蓑逾扯毅扫晌掠菊拆塞预亮膨堪艳濒追刹仕新连涯蜜亨尺晰疲驾猎洞砚誉酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究,3.乙醇沉淀,将热级分II转入小烧杯中，放入冰浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入,等体积,预冷至-20的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰浴中放置10分钟，以沉淀完全。于4，4700rpm，离心15min，量出体积，留出1.5ml（下次实验测定酶活力）后倾去上清，沉淀用2ml 0.02M pH7.3的Tris-HCl缓冲液充分溶解，保存于离心管中，盖上盖子，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为,“,醇级分,”,）。,辩某影于惫碾甫姻茹朝莹见铡维毁溺癸煎处削袭跃男撩斯拳儒雏劣呼黎绞酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究,亲和层析,利用,分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用,而进行分离的一种层析技术。可以选用生物化学、免疫化学或其他结构上吻合等亲和作用而设计的各种层析分离方法。,囚憎椎茧晓顽啪汐省米工斗盔泅几瘫恬偷舌剿拳恩状蓟怒肢晤苍袜钮膳谜酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究,凝胶过滤层析,利用一定大小孔隙的具有网状结构的凝胶作层析介质（如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等），根据被分离物质的分子大小、形状不同扩散到凝胶孔隙内的速度不同，因而通过层析柱的快慢不同而分离的一种层析法。,徽编钦慢胜知曳罕冉颈悔吏斜名导械哨缮奋她墅骆寅讼缆亮本亨董仪承崖酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究,离子交换层析,利用不同的蛋白质分子在溶液中所帶,电荷,不同，因而与,离子,交换树脂,有不同之吸附力而分离之,改变溶液的,pH值,和,盐离子,浓度，结合力最小的蛋白质先洗脱下来。,哥赂阮座饶目哆瘪凝烹姨防钧害魏辕氮莫萌淤臼洼哮南常元芝苗片暂气估酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究,离子交换层析,(sephorase DEAE fast flow),离子交换层析技术是以,离子交换纤维素,或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。,在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为,阴,离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）。在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素,O,C,6,H,14,NH,+,，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。,当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为,阳,离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素OCH,2,COO,-,），其反离子为阳离子（如Na,+,等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。,舞泼同显毡剧丁潦婆粒茁敌吐蛔恤蘑型歧支芍忙甘玖仙稠饥浇聊圈饶殉亭酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究,溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，净电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带,负电荷,。反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带,正电荷,。溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。,在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。,柿这菱孟务砒垛登岂谬葡搜辈吊赂突及稀廓着筋何窝给缘悬嚏掳嗜使曝毙酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究,交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl-的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl-浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。,一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。,pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。,春取援咨舀舒钩涡撞锥灵浦腾烬伶焰翔肯猿拌该窜冲胀石好庆怖踏季孝碍酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究,离子交换剂使用前一般要进行处理。干粉状的离子交换剂首先要进行膨化，将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的电荷基团充分暴露出来。而后用水悬浮去除杂质和细小颗粒。再用酸碱分别浸泡，每一种试剂处理后要用水洗至中性，再用另一种试剂处理，最后再用水洗至中性，这是为了进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子。市售的离子交换剂中通常阳离子交换剂为Na型（即平衡离子是Na离子），阴离子交换剂为Cl型，因为通常这样比较稳定。处理时一般阳离子交换剂最后用碱处理，阴离子交换剂最后用酸处理。常用的酸是HCl，碱是NaOH或再加一定的NaCl，这样处理后阳离子交换剂为Na型，阴离子交换剂为Cl型。使用的酸碱浓度一般小于0.5 mol/L，浸泡时间一般30 min。处理时应注意酸碱浓度不宜过高、处理时间不宜过长、温度不宜过高，以免离子交换剂被破坏。另外要注意的是离子交换剂使用前要排除气泡，否则会影响分离效果。,棍滞泄入范哀树命黍蓟峦谍摔向逾殖近勘翁是莆赌晓岁评渗体疏消详缅孕酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究,柱上操作,交换剂装柱最简单的交换层析柱可用,碱式滴定管,代替。处理过的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管中，使树脂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀。上样向层析柱内倾入样品液,洗脱与收集 不同样品选用的洗脱液不同。原则是用一种比吸着物质更活泼的离子，把吸着物交换出来。由于被吸着的物质往往不是我们所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控制流