生物技术抗体制药培训课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物技术抗体制药,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物技术抗体制药,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物技术抗体制药,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,生物技术抗体制药,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物技术抗体制药,生物技术抗体制药,第一节 概述,1890,年,Behring,和北里柴三郎,发现白喉抗毒素,建立了血清疗法,开创了抗体制药。,1937,年,Tiselius,用电泳法将,血清蛋白分离为白蛋白、,、,、,球蛋白，并证明抗体活性主要,存在于,球蛋白组分。,2,生物技术抗体制药,抗体,是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。,抗体的产生,：机体免疫系统受抗原刺激后，,B,淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。,3,生物技术抗体制药,20,世纪,60,年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中出现同抗体结构类似的球蛋白，统称为,免疫球蛋白,（,immunoglobulin,，,Ig,）。所以,Ig,是化学结构的概念，而,抗体,是生物学功能的概念。,4,生物技术抗体制药,多克隆抗体,：病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称多克隆抗体。,5,生物技术抗体制药,1975,年,Kohler,和,Milstein,首先利用,B,淋巴细胞杂交瘤技术制备出,单克隆抗体,（,monoclonal antibody,McAb,）。,单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源稳定、可大量生产等特点，为抗体制备和应用提供了全新的手段，还促进了基础和临床医学的发展。,6,生物技术抗体制药,单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要用与疾病的诊断和治疗。,单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断。用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。,7,生物技术抗体制药,单克隆抗体用于临床治疗，,CD3,单克隆抗体作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有抑制作用。,以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行定向治疗。,8,生物技术抗体制药,第二节 单克隆抗体,单克隆抗体,是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。,9,生物技术抗体制药,10,生物技术抗体制药,11,生物技术抗体制药,一、抗原与动物免疫,制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。,有的抗原可以用化学合成：地高辛,多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。,12,生物技术抗体制药,为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物和骨髓瘤细胞供体同一品系动物进行免疫。,目前常用的骨髓瘤细胞系多来自,BALB/c,小鼠和,LOU,大鼠，因此免疫动物也采用相应的品系。,13,生物技术抗体制药,免疫的方法,采用体内免疫法和体外免疫法。,体内免疫法,适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用,8,12,周龄雌性鼠。,颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔,10,个细胞进行初次免疫，间隔,1,3,周，再追加免疫,1,2,次。,7,14,生物技术抗体制药,可溶性抗原按每只小鼠,10,100g,抗原与福氏完全佐剂等量混合后注,入腹腔内，进行初次免疫，间隔,2,4,周，再用不加佐剂原抗原追加免疫,1,2,次。,一般再采脾细胞前,3,日由静脉注射最,后一次抗原。刺激,B,细胞分裂。,15,生物技术抗体制药,脾内免疫法即在麻醉下直接将,0.1,0.2ml,抗原注入脾脏进行免疫。细胞抗原需,10,5,个，,可溶性抗原需,10g,。,16,生物技术抗体制药,体外免疫法用于不能采用体内免疫的情况下，如制备人源性单克隆抗体；免疫源性极弱，易引起免疫抑制。,优点：需抗源量少，免疫期短，干扰因素少。,17,生物技术抗体制药,体外免疫法：用,4,8,周龄,BALB/c,小鼠的脾脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达,0.5,5g/ml,在,5%CO,37 C,下培养,4,5,天,再分离脾细胞,进行细胞融合。,o,2,o,18,生物技术抗体制药,二、细胞融合与杂交瘤细胞的 选择性培养,细胞融合的方法：,脾细胞（,110,）,骨髓瘤细胞（,210,）混合,聚乙二醇诱导下融合，,2,分钟，然后用培养液将融合液缓慢稀释。,8,7,19,生物技术抗体制药,用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具有融合率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强，长期稳定。,PEG,相对分子量,4000,，浓度为,50%,二甲基亚砜增加融合率。,20,生物技术抗体制药,细胞融合后可产生多种融合。,脾,脾、脾,瘤、瘤,瘤融合细胞。,选择性培养,:,培养基 为,HAT,培养液。次黄嘌呤,(H),氨甲喋呤,(A),胸腺嘧啶,(T),配制。,A,阻断,DNA,合成。,21,生物技术抗体制药,22,生物技术抗体制药,三、筛选阳性克隆与克隆化,筛选阳性克隆常用检测方法：,免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。,克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。,23,生物技术抗体制药,ELISA,用于破伤风抗体的筛选,24,生物技术抗体制药,五、,单克隆抗体的大量制备,体外培养法可获的,10g/ml,抗体,体内诱生法可获的,5,20mg/ml,抗体,用,BALB/c,小鼠。,降植烷 接种杂交瘤细胞 取腹水 离心 上清。,26,生物技术抗体制药,六、,单克隆抗体的纯化,依单抗,IgG,类和亚类不同，选各种不同的纯化方法。,体内诱生法,单克隆抗体的,纯化方法：,1,离心 取上清，超滤，盐析。,2,分离 凝胶过滤用于,IgG IgM,单抗纯化。阴离子交换层析,IgG,单抗纯化。亲和层析,IgG,单抗纯化。,27,生物技术抗体制药,第三节 鼠源性,单克隆抗体的改造,杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体产生人抗鼠抗体及毒副作用。对鼠源性的单抗进行基因加工和改造。,目的：降低免疫源性；降低相对分子量。,人,-,鼠嵌合抗体、改形抗体、小分子抗体。,28,生物技术抗体制药,29,生物技术抗体制药,Ig,分子结构,30,生物技术抗体制药,Ig,分子的基因结构,31,生物技术抗体制药,一、人鼠嵌合抗体,抗原抗体结合功能,抗体可变区（,V,）,同种性免疫源性,抗体稳定区（,C,）,在基因水平上将鼠源单抗的,H,和,L,链可变区基因分离出来，分别与人,Ig,的,H,和,L,链的稳定区（,C,）基因连接成人,-,鼠嵌合抗体的,H,和,L,链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人,-,鼠嵌合抗体。,32,生物技术抗体制药,二、改形抗体（,CDR,移植抗体）,Ig,分子中参与构成抗原结合部位的区域是,H,和,L,链,V,区中的互补决定区（,CDR,区），而不是整个可变区。,H,和,L,链各有三个,CDR,，其它部分称框架区。,用,鼠源单抗的,CDR,序列替换人,Ig,分子中,CDR,序列，则可使人的,Ig,分子具有,鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫源性。,33,生物技术抗体制药,34,生物技术抗体制药,三、小分子抗体,基因工程小分子抗体仅表达鼠源单抗的,V,区片段，相对分子量为原抗体的,1/80,1/3,。即保留,CDR,区，而,Ig,分子中的,C,区,不表达。,小分子抗体类型有：,Fab,片段抗体,Fv,抗体,单链抗体,35,生物技术抗体制药,单域抗体,最小识别单位,单链抗体的优点：,可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显象背景更加清晰性。,易渗透肿瘤组织中增加药物治疗浓度。,免疫源性小，可消除人抗鼠的排异反应。,36,生物技术抗体制药,单链抗体大多在大肠杆菌中表达，有三种形式：,直接在细胞质中表达；,与其它菌体融合表达融合蛋白；,分泌表达具有功能的单链抗体,。,37,生物技术抗体制药,四、双功能抗体,双功能抗体就是双特性抗体。它是一种非天然性抗体。其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。,构建方法：,化学交联法,生物学方法（杂种,-,杂交瘤）,基因工程法,38,生物技术抗体制药,五、抗体融合蛋白,抗体融合蛋白广义属双功能抗体。,类型：,配基,-,配基型融合蛋白；,配基,-Ig,型嵌合蛋白；,配基,-Fv,型融合蛋白；,受体,-Fv,型融合蛋白；,酶,-,抗体型融合蛋白；,39,生物技术抗体制药,