[优选文档]和检测与临床应用PPT

,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,和检测与临床应用课件,汇报内容,KRAS,和,EGFR,的简介及临床意义,ARMS-PCR,的基本原理和技术特点,等位特异性引物设计,KRAS,试剂盒开发简介,KRAS,和,EGFR,的简介及临床意义,Two sets of primers,either forward or reverse primers can be designed.,2235-2253del18,2240-2257del18,2236-2250del15,因此设计两条上游（或下游）引物，使其3末端分别与突变位点碱基匹配和错配，共用下游（或上游）引物，分别扩增野生型和突变型目的片断。,2239-2251 C(complex),如重复检测3次均显示扩增曲线阳性，该样本结果判读为突变型；,5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3,2307-2308 ins GCCAGCGTG,2307-2308 ins GCCAGCGTG,95C预变性10分钟95C 15秒,KRAS基因野生型的非小细胞肺癌患者能从小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI，如吉非替尼、厄洛替尼）治疗中获益，而基因突变的患者易发生抵抗；,KRAS基因序列和常见突变,ARMS-PCR和双环探针技术,下游引物：1条（检验特异性）,5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3,If a common reverse or forward primer is used in a PCR reaction,the reaction is called allele-specific PCR(AS-PCR).,当3端是中度错配（A/A，C/C，G/G 或T/T）则需要引入中度的错配。,KRAS,背景,KRAS,是一种原癌基因，长约,35kb,，位于,12,号染色体，是,RAS,基因家族成员之一，编码的蛋白主要参与,PI3K,、,PTEN,、,AKT,和,RAF,、,MEK,、,ERK,信号通路的调控；,EGFR,在通路中位于,KRAS,上游，配体与之结合后可以激发其酪氨酸激酶活性，导致,KRAS,的活化和通路中信号传导；,KRAS,是许多恶性肿瘤的常见突变基因：胰腺癌（,65%-90%,）、结直肠癌（,40%,）、肺癌（,20%,）、卵巢癌（,15%,）。,KRAS,基因突变影响结直肠癌药物疗效,KRAS,基因野生型的转移性结直肠癌患者能从,EGF,抗体（西妥昔单抗、帕尼单抗）治疗中获益，而基因突变的患者治疗效果很差；,KRAS,突变型患者对西妥昔单抗无应答，其总体生存期明显低于,KRAS,野生型患者,Karapetis CS,2008,N Eng J Med,结直肠癌患者检测,KRAS,突变相关指南,欧洲药品评估局（,EMEA,，,2008,）指出：,KRAS,野生型的进展期结直肠癌患者可能从帕尼单抗中受益，而突变型患者受益较少。,美国临床肿瘤学会（,ASCO,，,2009,）推荐：转移性结直肠癌患者应检测,KRAS,突变，如有,KRAS12,、,13,位突变，则不应进行,EGFR,单克隆抗体治疗；,美国,FDA,指南推荐：在使用靶向药物西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性结肠直肠癌前必须检测,KRAS,基因的基因型；,2012,年,7,月,6,日批准第一个用于结直肠癌的基因检测（,Qiagen,），以判断西妥昔单抗是否有效；,美国国立综合癌症网络（,NCCN,，,2014,）指南说：转移性结直肠癌患者均应进行,RAS,突变检测（,KRAS,和,NRAS,），至少应检测,KRAS,第二外显子的突变情况。,KRAS,或,NRAS,突变型的病人不应采取西妥昔单抗或帕尼单抗治疗。,中国卫生部于,2010,年,10,月,14,日发表了结直肠癌诊疗规范（,2010,版）。明确指出在患者确定为复发或转移性结直肠癌接受,西妥昔单抗,、帕尼单抗时，必须检测肿瘤组织的,K-ras,基因状态。在晚期,/,转移性结直肠癌化疗中，在治疗前检测肿瘤,K-ras,基因状态，,EGFR,不推荐作为常规检查项目。,KRAS,基因突变影响非小细胞肺癌药物疗效,KRAS,基因野生型的非小细胞肺癌患者能从小分子酪氨酸激酶抑制剂（,TKI,，如吉非替尼、厄洛替尼）治疗中获益，而基因突变的患者易发生抵抗；,KRAS,突变型患者使用厄洛替尼联合化疗后，其无症状生存期和总生存期明显低于野生型患者（图中红线所示）,Anderson SM,2011,Expert Rev.Mol.Diagn,Eberhard DA,2005,J Clin Oncol,非小细胞肺癌患者检测,KRAS,突变相关指南,美国国立综合癌症网络（,NCCN,，,2009,）指出，,KRAS,突变与非小细胞肺癌患者,TKI,抵抗有关，,KRAS,基因测序有助于确定哪些病人适合,TKI,治疗。当,KRAS,基因发生了突变，则不建议病人使用厄洛替尼进行分子靶向治疗。,KRAS,主要突变位点,在结直肠癌中，,KRAS,突变主要发生于,codon12(80%),、,codon13(15-20%),、,codon61,和,146(C,6239,G719S,18,2155GA,6252,G719C,18,2155GT,6253,E746-A750del(1),19,2235-2249del15,6223,E746-A750del(2),19,2236-2250del15,6225,L747-P753S,19,2240-2257del18,12370,E746-A750I,19,2235-2252AAT(complex),13551,E746-A750del,19,2235-2253del18,12728,E746-A750A,19,2237-2251 del15,12678,E746-S752A,19,2237-2254 del18,12367,E746-S752V,19,2237-2250 T(complex),12384,E746-S752D,19,2238-2255 del18,6220,L747-A750P,19,2238-2248 GC(complex),12422,L747-T751Q,19,2238-2252 GCA(complex),12419,L747-E749del,19,2239-2247del9,6218,L747-T751del,19,2239-2253del15,6254,L747-S752del,19,2239-2256del18,6255,L747-A750P,19,2239-2248TTAAGAGAAG C,12382,L747-P753Q,19,2239-2258CA(complex),12387,L747-T751S,19,2240-2251del12,6210,L747-T751del,19,2240-2254del15,12369,L747-T751P,19,2239-2251 C(complex),12383,T790M,20,2369C T,6240,S768I,20,2303GT,6241,V769-D770insASV,20,2307-2308 ins GCCAGCGTG,12376,H773-V774insH,20,2319-2320 ins CAC,12377,D770-N771insG,20,2310-2311 ins GGT,12378,L858R,21,2573TG,6224,L861Q,21,2582TA,6213,EGFR,突变与,EGFR-TKI,药物疗效关系,所在外显子,突变类型,与,EGFR-TKI,疗效关系,18,G719A(S/C)3,种点突变,药敏突变,19,19,种缺失突变,药敏突变,20,点突变,S768I,药敏突变,20,点突变,T790M,耐药突变*,20,3,种插入突变,耐药突变*,21,点突变,L858R,药敏突变,21,点突变,L861Q,药敏突变,ADx EGFR,试剂盒突变结果检测,组别,突变类型,所占比例,对吉非替尼敏感性,证据,1,Exon 19 deletions;L858R,90%,充分,2,T790M/deletion;T790M/L858R;,G719X;L861Q;S768I,7%,有限,3,T790M alone;Exon 20 insertions;,other mutations,3%,无,ARMS-PCR,的基本原理和技术特点,ARMS-PCR,原理,ARMS,是,Amplification Refractory Mutation System(,扩增阻碍突变系统,),的缩写。,根据,PCR,过程中要求引物和模板间的严格互补配对来实现对突变位点的检测,当引物,3,末端出现错配时,产物将不能延伸。,因此设计两条上游（或下游）引物，使其,3,末端分别与突变位点碱基匹配和错配，共用下游（或上游）引物，分别扩增野生型和突变型目的片断。,ARMS-PCR,原理,Two Allele-Specific(AS)primers,one for each allele of a SNP are designed.The AS primers contain one of two polymorphic nucleotides at the primer 3 end.Two sets of primers,either forward or reverse primers can be designed.If a common reverse or forward primer is used in a PCR reaction,the reaction is called allele-specific PCR(AS-PCR).,You F.M.2008,BMC Bioinformatics,PCR,产物检测,-Real time PCR,每个,PCR,循环,检测荧光信号,，,不同,PCR,产物，不同荧光信号,相比凝胶电泳：更快，可定量，无,PCR,产物污染,信号产生方法：,Scorpion(Qiagen),，双环探针,(,厦门艾德,),，,Taqman,，,Molecular beacons,，,Sybr green,，,Yo-pro,Figure 2 The sensitivity of QuanTAS-PCR for quantifying JAK2 mutant alleles.,Zapparoli G.V.2013,BMC Cancer,应用于,Real time-PCR,的,ARMS-PCR,G,C,A,T,G,A,A,G,G allele,A allele,5,5,5,5,3,3,3,3,AS primer,AS primer,Mismatch,Mismatch,Reverse primer,Reverse primer,FAM-5,3-BHQ1,FAM-5,3-BHQ1,Probe,Probe,ARMS,技术