纤维素酶专题知识培训课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,纤维素酶专题知识,*,纤维素酶专题知识,引言,纤维素是世界上蕴藏量最丰富的天然高分子化合物，绝大多数由绿色植物通过光合作用合成。据估计，地球纤维素每年通过光合作用的更新量约为,4.0X 10,10,吨。,纤维素是地球上最丰富的多糖物质，是植物细胞壁的主要组分，占植物秸秆干重的,l,3,l,2,，也是自然界存在的最多的一类可再生生物聚合物。,依赖于人们对纤维素酶的发现和认识。纤维素为一种具有巨大潜力的。,2,纤维素酶专题知识,全世界农作物秸秆年产量超过,20,亿吨，仅我国每年秸秆产量就高达,7,亿吨。由于其中含有大量的纤维素，营养价值低，难以被畜禽利用，因此只有很少一部分用作饲料，少量用来过腹还田或直接还田嘲，而大约有,45,47,作为燃料补充农村能源不足，,15,以烧荒形式烧掉或丢弃。秸秆直接利用率较低，如不对这类纤维素废物加以有效地利用，不仅会严重污染环境，而且也造成资源的极大浪费，因此探索纤维素类废弃物的处理措施，对其进行有效利用是,21,世纪的重大课题。,引言,3,纤维素酶专题知识,纤维素的结构,4,纤维素酶专题知识,什么是纤维素酶？,纤维素酶：纤维素酶是酶的一种，在分解纤维素时起生物催化作用,是多组分酶体系，是具有纤维素降解能力酶的总称。,按照纤维素降解微生物和纤维素酶系之间的关系，可将纤维素酶系分为三类：,一是对天然纤维素的降解能力比较弱，但可大量合成分泌到胞外的纤维素降解酶系，酶的组分是游离的，如常见的木霉、青霉的纤维素酶系；,二是对天然纤维素降解能力强，但分泌到胞外的纤维素酶系活力较低，如担子菌类等；,三是对天然纤维素分解能力强，但基本无纤维素酶分泌到胞外，如厌氧细菌的纤维素酶系。,5,纤维素酶专题知识,纤维素酶的组成及性质,1,：外切葡聚糖酶包括两类酶，,一类：是,-1,，,4-D-,葡聚糖一葡萄糖水解酶，也称为纤维素糊精酶,(Ec3.2.1.74),；,二类：酶为纤维二糖水解酶,(cellobiohydrolases CBH),，即,-1,，,4-D-,葡聚糖一纤维二糖水解酶,(exo-B-1,，,4-D-glucanases,，,EC3.2.1.91),，简称外切酶。,CBH,是纤维素酶系中的重要组分，在天然纤维素的降解过程中起主导作用，可以水解微晶纤维素和棉花等结晶度高的纤维素，作用于无定形纤维素的非还原末端或还原端，水解,-1,，,4,一糖苷键，依次切下一个纤维二糖分子，生成可溶的纤维糊精和纤维二糖。,6,纤维素酶专题知识,2:,内切纤维素酶,(endoglueanases,，,EG),或内切葡聚糖酶，即内切,1,，,4-D-,葡聚糖,q,一葡聚糖水解酶,(endo-glucanasea,，,EC3.2.1.4),，简称内切酶，也称,cx,酶，,CMC,酶。内切纤维素酶随即地水解磷酸膨胀纤维素，羧甲基纤维素等无定形纤维素的非定形区，无规则水解,-1,，,4,糖苷键，形成葡萄糖、纤维二糖纤维三糖和不同大小的纤维糊精，为纤维二糖水解酶提供更多的可供水解的末端。,纤维素酶的组成及性质,7,纤维素酶专题知识,3,：,-,葡萄糖苷酶,(-glucosidases,，,-6,或,BG),或,-D-,葡萄糖苷一葡萄糖水解,(EC3.2.1.21),，又称纤维二糖酶,(cellobiase,，,CB),，它主要裂解纤维二糖和从小的纤维素糊精的非还原末端水解葡萄糖残基，生成葡萄糖产物。它的水解速率随底物大小的降低而增加，以底物为纤维二糖时水解速率最快咖。严格地讲，,-,葡萄糖苷酶不能算作纤维素酶，但它可以减轻纤维二糖对纤维素酶的反馈抑制作用。,纤维素酶的组成及性质,8,纤维素酶专题知识,纤维素酶理化特性,一：分子量,不同来源、不同组分的纤维素酶分子量差别较大，其变化范围很广。,目前普遍认为：,1.,内切酶分子量介于,23,146kDa,；（但有研究认为）内切酶相对分子量介于,23,118kDa(,胞内酶,),和,47,76kDa(,胞外酶,),。,2.,真菌,EG,的两种异构酶，,EGI,的分子量约为,54kDaEG,的分子量约为,49.8kDa,。,3.,外切酶分子量介于,38,118kDa,，木霉属真菌产的,CBH 1,分子量约为,66kDa,，,CBHII,的分子量为,53kDa,；,13,葡萄糖苷酶为,90,l00kDa(,胞内酶型,),和,47,76kDa(,胞外酶型,),。,9,纤维素酶专题知识,纤维素酶理化特性,二：等电点,等电点,(pI),是蛋白质分子的重要理化特征。纤维素酶系中各组分的等电点随菌种来源、培养条件的变化而异。,一般认为，木霉属真菌产的,CBHI,的,pI,值约为,4.2,，,CBHII,的,pI,值约为,5.9,。真菌,EGI,的,pI,值约为,4.7,，,EGUI,的,pI,值为,4.8,5.6(,也有报道约为,7.47),，,BG,的,pI,值约为,7.5,8.5,。,10,纤维素酶专题知识,纤维素酶理化特性,三：最适温度,酶反应存在一个最适温度。一般纤维素酶的最适温度范围为,4060,。纤维素酶各组分热稳定性也存在差异，内切酶,(Cx),的最适温度为,50,60,，热稳定性好，在,95,时仍保留一般的酶活性；不同来源的,葡萄糖苷酶的最适温度均为,50,60,。然而有研究报道，,葡萄糖苷酶具有很高的耐温性，在,50,保温,60h,，仍保持,95%,以上的活性，最适温度为,70,。也有报道，康宁木霉中的外切酶,(C,1,),具有特殊的热稳定性，其最适温度为,40,60,。,11,纤维素酶专题知识,纤维素酶理化特性,四：,纤维素酶的最适,ph,值,纤维素酶酶活对环境,pH,值很敏感，不同菌种、不同组分的纤维素酶最适,pH,值有差异。如曲霉、青霉及木霉产生的酸性纤维素酶，一般在酸性环境,pH4.0,5.0,有较高活性。田新玉从,200,余株嗜碱细菌中筛选到一株产碱性纤维素酶的菌株,N6227,，其酶反应的最适,pH,值为,8.5,。内切酶,(cx),的最适,pH,值为,5.0,7.0,；,C,1,酶和,BG,最适,pH,值为,5.0,左右，,BG,在,pH,值,4.0,8.0,时稳定。,12,纤维素酶专题知识,纤维素酶理化特性,五：纤维素酶的多样性,产纤维素酶微生物一般,不会只有,一类纤维素酶组分。试验证明，,S.pulverhlentum,培养液就包括五种内切葡聚糖酶和两种不同的,BG,。,T.emersonii,的胞外酶包括三种,BG,、四种,cx,和五种外切酶。即使只产生一类纤维素酶组分，也往往有多种不同的形式。,Elena,S,等报道，一种白热担子菌,(phanerochaete chrysosporium),依靠碳源，能在细胞外、细胞内和细胞壁上产生三种不同的,BG,，其相应的相对分子量分别为,96kDa,、,98kDa,和,114kna,。同一微生物，也可能因为不同的地区来源、不同的培养条件而使得纤维素酶的成分有很大差别，这也是纤维素酶多样性的表现。,13,纤维素酶专题知识,纤维素酶理化特性,六：纤维素酶的诱导性,真菌纤维素酶是诱导酶，在诱导物存在下才能产生。许多不溶性的纤维素、可溶性的纤维素衍生物、一些低聚糖类以及某些单糖和二糖均可作为纤维素的诱导物。,Nisizawa,研究发现，纤维素、纤维二糖、槐糖、纤维索衍生物等都能诱导里氏木霉和绿色木霉产生纤维素酶。然而值得注意的是，纤维二糖、葡萄糖等低分子可溶性糖在低浓度时有促进作用，而较高浓度时便开始抑制。当然，对于不同微生物来说，同一浓度、同一物质也可能有着不同甚至完全相反的作用。,14,纤维素酶专题知识,纤维素酶的作用原理,纤维素酶降解纤维素的部位优先发生在无定形区的理论已得到普遍认可。,这种理论认为，首先内切型纤维素酶作用于纤维素分子内部的无定形区，随即水解,-1,，,4-,糖苷键，将纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分予纤维素，随后外切型纤维素酶，又称纤维二糖水解酶，作用于纤维素线状分子末端，水解,-1,，,4-,糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。最后，葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。,15,纤维素酶专题知识,16,纤维素酶专题知识,纤维素酶的发酵工艺,纤维素酶的分布非常广泛，主要有三个来源：,1,微生物来源：主要有霉菌、担子菌等真菌，也包括细菌、放线菌和一些原生动物。真菌中活力较高的是木霉、黑曲、青霉和根霉等，细菌中有纤维杆菌、球形生孢纤维粘菌等，目前研究较多的是绿色木霉和纤维杆菌；,2,是动物性来源：利用反刍动物瘤胃液制备纤维素酶的粗酶制剂；,3,生物工程来源：迄今，人们已从,40,多种细菌和数种真菌中克隆到了纤维素酶基因，并构建了这些酶的基因文库。同时，利用基因工程手段对纤维素酶分子进行改造，使其活性提高，耐受性增强。,17,纤维素酶专题知识,培养基,选择培养基以羧甲基纤维素钠,(CMC-Na),取代查氏培养基中的蔗糖，其余配方不变；,种子培养基为,0.7 5,CMC-Na,0.5,蛋白胨，,2,吐温,8 0,，,0.0 3,MgSO,4,、,CaCl,2,，,H,2,O,，微量,FeSO,4,MnSO,4,ZnSO,4,CoCI,2,，自然,p H,；,发酵培养基为,0.7 5,CMC-N a,，,(NH,4,),2,SO,4,，,2,吐温,8 0,，其余同种子培养基,18,纤维素酶专题知识,方法,1.,刚果红染色法 菌落长成后，往选择平板中加入适量,110-3g,mL,的刚果红溶液，染色,l h,；弃去染液，加入适量,lmo l/L,的,NaCI,溶液，洗涤,1 h,菌体若能分泌纤维素酶，则在菌落周围会出现清晰的透明 水解圈，依据透明圈与菌落直径比值的大小选择产酶菌株,2.,还原糖的测定 采用,3,，,5,二硝基水杨酸法,(DNS,法,),19,纤维素酶专题知识,方法,3.,滤纸酶,(FPase),活性测定：试管底部预先放置适当大小的滤纸,(,约,5 0 mg),，加入,1mL,样品与,1.5 mL,柠檬酸一,Na 2 HP O4,缓冲液,(0.2 mo l,L,，,p H5.0),，,50,保温,1 h,，扣除本底,测定反应后还原糖的含量 酶活定义为上述条件下，每小时催化生成,lg,葡萄糖的酶量为一个,U,20,纤维素酶专题知识,菌种选育,采集到的土壤样本经无菌水洗涤后，吸取上清液梯度稀释，选取适当浓度涂布选择培养基，挑选出几 株菌，纯化保藏 用刚果红染色法在选择培养基中复筛，挑选出,4,株有较强纤维素水解能力的菌株，液体培 养基中发酵，测其纤维素酶的活性，选择其中酶活性最高的一株保藏备用。,21,纤维素酶专题知识,发酵过程,22,纤维素酶专题知识,纤维素酶的发酵工艺,一,:,固体发酵工艺,1,固体发酵工艺特点,:,固体发酵法又称麸曲培养法，是以秸秆粉、废纸、玉米秸秆粉为主要原料，拌入种曲后装入盘或帘子上，摊成薄层,(,厚约,1 cm),，在培养室一定温度和湿度,(RH 90,一,100,),下进行发酵。,其主要特点是发酵体系没有游离水存在，微生物是在有足够湿度的固态底物上进行反应，发酵环境接近于自然状态下的微生物生长习性，产生的酶系更全，有利于降解天然纤维素，且投资低、能耗低、产量高、操作简易、回收率高、无泡沫、需控参数少、环境污染小等。但固体发酵法易被杂菌污染，生产的纤维素酶分离纯化较难且色素不易去除。,23,纤维素酶专题知识,纤维素酶的发酵工艺,2,固体发酵设备浅盘发酵器,是比较常用的一种固态发酵设备，培养基经灭菌冷却后装入浅盘，通过空气增湿器调节空间的温湿度进行发酵，工业化程度较低。固体发酵设备发展的趋向是机械化发酵罐，尤其是流化床式固体发酵设备，发酵效果将更好。,3,固体发酵工艺流程,24,纤维素酶专题知识,4,固体发酵工艺条件,固体发酵过程中的温度、湿度、时间、水分、,pH,值等因素及其交互作用对发酵有显著影响，对周态发酵而言，温度是首要因素。培养基及培养条件的优化，是降低酶制剂成本