薄层色谱和柱层析课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,01:22:47,#,11:01:02,将溶剂抽提中的一个相固定在硅胶上，装在柱内，并按色谱法操作，使另一液相流过柱子，分离获得成功。从此出现了基于分配原理的分配色谱法，因此获得了诺贝尔奖。以后的发展采用了纤维素、继而采用滤纸作分配色谱载体，发展了纸色谱法。薄层色谱法的研究和发展也出现在二十世纪的三、四十年代，现在已和气、液色谱一起成为最常用的色谱分离、分析方法。为与柱色谱相区别，并突出纸色谱和薄层色谱的特点，这两种方法也叫平床色谱法（,Flat bed chromatography,）或平面色谱法（,Planar chromatography,）。,色谱法经过多年的发展已有多种操作形式，其分类方法也有多种。按固定相和流动相的物态可分为以气体为流动相的气相色谱（包括气固色谱、气液色谱）和以液体为流动相的液相色谱（包括液固色谱、液,-,液色谱）；如以固定相的操作方式以及形状分类则有柱色谱、,纸色谱、薄层色谱；,18:20:49 将溶剂抽提中的一个相固定在硅胶上,1,11:01:02,2-,薄层色谱中，组分的移动情况常用比移值,Rf,来表示：,R,f,=,原点至组分点中心的距离,/,原点至流动相前沿的距离,也有用,“,高比移值,”,表示：,hR,f,=R,f,100,和,“,相对比移值,”,表示，即相对于某一物质,X,的,R,f,值，用,R,x,表示：,R,x,=R,f,/R,x,（原点至组分点中心距离与原点至物质,X,点中心的距离的比值）,R,f,总小于,1,；,R,x,可小于,1,，也可大于,1,；,hR,f,可在,1,100,之间,18:20:49 2-薄层色谱中，组分的移动情况常用比移值R,2,11:01:02,薄层色谱中，,Rf,值与组分的分配系数,K,值有关：,K=C,s,/C,M,=,溶质在固定相中浓度,/,溶质在流动相中浓度,若该组分的移动距离为,d,1,，流动相移动距离为,d,m,d,2,=d,m,d,1,R,f,=d,1,/d,m,=d,1,/(d,1,+d,2,),如果组分的分配系数大，则在水中分配量大，移动距离小，,R,f,小。因此，,K,与,d,1,、,d,2,有如下关系：,Kd,2,/d,1,此外，移动距离也与二相之体积比有关，体积大者，在其中分配的量也多。如以,V,s,表示固定相的体积，,V,m,表示流动相的体积,V,s,/V,m,d,2,/d,1,18:20:49薄层色谱中，Rf值与组分的分配系数K值有关：,3,11:01:02,合并上两式：,d,2,/d,1,=KV,s,/V,m,R,f,=d,1,/(d,1,+d,2,)=d,1,/(d,1,+d,1,KV,s,/V,m,),=V,m,/(V,m,+KV,s,),或,K=V,m,/V,s,(1/R,f,1),若实验条件固定，则两相体积比也固定不变，则决定,R,f,的主要因素是分配系数,K,。由,K,值可推倒出,R,f,值。但有时纸纤维对某些物质也有作用，从而使实测,R,f,值与计算（推倒）,R,f,值有一定差别。,在分配色谱中，但固定液的极性大于流动相的极性时，称为正相分配；当固定液的极性小于流动相的极性时称为反相分配。通常纸色谱均为正相，即有机溶剂为流动相，吸收在滤纸上的水分作固定相。但有时也有将滤纸用极性较小的液体（如烃类）处理后作固定相，而以极性较大的含水溶剂作流动相，则为反相色谱。用,DMF,处理的仍然为正相。,18:20:49 合并上两式：,4,11:01:02,薄层色谱与,HPLC,的对比,薄层色谱,HPLC,色谱系统 开放式 闭路,展开方式 展开 洗脱,流速控制 吸附剂的毛细管作用 由泵调节,平衡时间 短 不定,分析样品 可同时分析多个 每次一个样品,样品量 高 低,板高（,m,）,30 2,5,有效板数,600,5000,检测方式 静态 动态,溶剂用量 少 多,溶剂更换 易 难,固定相 一次弃去 重复使用,18:20:49,5,11:01:02,4-,吸附剂与载体,（,1,）对吸附剂的要求,（,）具有大的表面积与足够的吸附能力,（,）对不同组分有不同吸附性能，这样有好的分离效果,（,）在所用溶剂和展开剂中不溶解,（,）不与试样中各组分、溶剂和展开剂起化学反应、破坏或分解作用,18:20:494-吸附剂与载体,6,11:01:02,（,）粒度均匀，使用过程中不破坏,（,）具有可逆的吸附性，既能吸附样品组分，又易于解析,（,）为便于观察分离结果，吸附剂最好为白色。,常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺、硅酸镁、而,CaO,、,MgO,、,Ca(OH),2,、,Mg(OH),2,、,CaSO,4,、,Ca,3,(PO,4,),2,、,Mg,3,(PO,4,),2,、淀粉、蔗糖等，或因碱性太大，或吸附性太弱，用途有限，活性炭因吸附性太强和黑色，使应用受到限制。,（,2,）分配色谱对载体的要求,（,）表面积大,（,）在展开剂中不溶，与展开剂和样品组分不起化学反应或分解作用,（,）对样品组分无吸附性或吸附性弱,（,）对固定液是惰性的,18:20:49（）粒度均匀，使用过程中不破坏,7,11:01:02,常用的有纤维素和硅藻土。,实际工作中，吸附剂、载体等的选择，首先决定于样品成分的性质，即它们的溶解度、酸碱性、极性以及是否与吸附剂起化学反应等，还有价格、是否容易得到等。,（,）样品的溶解度,任何类型的化合物都可首先考虑使用硅胶和氧化铝薄层，如果水溶性的化合物在吸附薄层上分离不好，可试用纤维素或硅藻土分配薄层，如果正相不行可选用反相。,（,）样品的酸碱性,硅胶略带酸性，适用于酸性和中性物质分离；碱性物质与硅胶有相互作用，展开时易吸附于原点不动或拖尾。,氧化铝呈碱性，适用于碱性和中性物质的分离。,硅胶和氧化铝,1,：,1,量掺和使用，得中性吸附剂，或在制板时加入稀酸或稀碱使其变性，或用酸性或碱性展开剂展开，以改变硅胶或氧化铝原来的性质。,18:20:49 常用的有纤维素和硅藻土。,8,11:01:02,（,）样品的极性,物质的极性愈大，氧化铝和硅胶吸附愈牢，物质极性大小如下：,饱和烃,不饱和烃,醚,酯,醛,酮,胺,羟基化合物,酸和碱,吸附太牢也不易分离，如果硅胶、氧化铝吸附性太强，可掺入不同比例的硅藻土，或其它低吸附性物质。,（,3,）常用吸附剂,硅胶：,105,110,活化，但不能高于,170,。,氧化铝：,180,200,活化,聚酰胺 纤维素硅藻土,硅酸镁 离子交换剂,多孔玻璃珠 反相键合硅胶（硅烷化处理）,18:20:49（）样品的极性,9,11:01:02,5-,薄层板的制备,将吸附剂均匀地涂铺在规定尺寸的玻璃板或其它平面板上，这一过程称铺板或铺层，即制成薄层板。,板的好坏是分离成功与否的关键，好的板要求吸附剂涂铺均匀，表面光滑，厚度一致。现有预制板出售。,制板方法主要有干法和湿法两种：,（,1,）干法制板,氧化铝和硅胶可用干法铺板，干法铺层比较简便，制得的板展开速度快，但展开后不能保存，薄层不牢固，喷显色剂时易吹散。,方法：将吸附剂均匀地撒在薄层板上，两手用两端圈套的玻璃棒滚动，厚度,0.25,3mm,，滚动不宜太快，不能停。,0.25mm,左右主要是分析和分离用，,3mm,的厚板主要是制备色谱用。,18:20:495-薄层板的制备,10,11:01:02,（,2,）湿法铺板,在吸附剂中加入少量粘合剂，加水调成糊状制板。湿法制得的半薄层牢固，不易脱落，易保存。氧化铝和硅胶均可用该法铺板，铺成的湿板经风干、活化等处理后即可使用。湿法铺板有三种方法：倾注法、平铺法和涂铺法。,倾注法：通过振动铺平，在,105,120,活化,0.5,2h,。粘合剂用锻石膏，干燥速度快，用羧甲基纤维素慢。,平铺法：二边有框,涂铺法：用涂铺器，厚度可调。,所用粘合剂有：锻石膏、羧甲基纤维素及某些聚合物如：聚丙烯酸等。,锻石膏的用量一般为吸附剂的,10,15%,羧甲基纤维素一般用,0.2,1.0%,的水溶液,淀粉用,5%,的水溶液。,18:20:49（2）湿法铺板,11,11:01:02,（,3,）薄层板类型,除上述正常的硅胶、氧化铝板外，还有一些板适用于化合物的分离和检出：,（,a,）荧光薄层板：吸附剂中加入荧光物质即得荧光板，可检出一些本身无色、在紫外光下也不显荧光的化合物，荧光板在紫外光照射下显荧光，而化合物斑点呈现暗点。,无机荧光物质有：在,254nm,紫外光下激发荧光，如锰激活的硅酸锌（,Zn,2,SiO,4,:Mn,），在,365nm,紫外光激发荧光，如银激活的硫化锌,.,硫化镉（,ZnS,2,.CdS:Ag,）,有机物有荧光素钠、桑色素,加入量为,0.5,1.5%,（吸附剂中）,18:20:49（3）薄层板类型,12,11:01:02,（,b,）络合薄层板,含有,AgNO,3,、,H,3,BO,3,或,Na,4,B,4,O,10,等化合物的板与某些化合物在展开过程中形成络合物。如,AgNO,3,络合薄层可用来分离碳原子数相同、而,C=C,双键数目不等的一系列化合物，如不饱和醇、酸等，原因是,Ag,+,可与,C=C,形成络合物，饱和的吸附弱，,Rf,高，双键数目不同，,R,f,亦不同。含多羟基的长链脂肪酸和它们的甲酯及酚等均可与硼酸、硼砂络合。,（,c,）酸碱薄层板和,pH,缓冲薄层板：有些化合物在普通板上分离不好时，可通过改变原来吸附剂的酸碱性，改善分离效果。如在铺层时用稀酸（一般用,1,4%,的盐酸或,0.1,0.25mol/L,草酸溶液）代替水制成酸性板，使生物碱形成离子对而分离。,（,d,）混合薄层板：两种不同吸附剂按一定比例混合，制板，也可分段铺板，前段预处理，以吸附杂质，后段分离。,18:20:49（b）络合薄层板,13,11:01:02,（,e,）径向薄层板：径向板铺法与一般板不同，点样前按下法处理：,刮去 刮去,用此板展开，可使,R,f,值相近的化合物得到较好的分离，且灵敏度高。,（,f,）梯度薄层板：梯度是指由一种性质到另一种性质的变化。梯度薄层与常规薄层不同，它显示出具有渐变的分离性能，如有两种不同吸附剂的比例渐变（吸附性梯度）；用不同,pH,值溶液（,pH,梯度）或,AgNO3,浓度（,0.5,10%,浓度梯度）铺层；用不同粒度吸附剂铺层（粒度梯度）。,18:20:49（e）径向薄层板：径向板铺法与一般板不同，点,14,11:01:02,（,g,）烧结板：由玻璃粉（作粘合剂）与硅胶或氧化铝等吸附剂按一定比例混匀后，经高温烧结而成，该板可一此制备多次使用。,吸附剂 粘合剂 配 比 烧结条件,硅胶 玻璃粉,1,：,2,5 470,770,，,7,10min,氧化铝 玻璃粉,1,：,1,4 470,870,，,7,10min,硅藻土 玻璃粉,1,：,1,6 470,770,，,7,10min,（,h,）旋转薄层板：旋转薄层色谱由称离心薄层色谱，用于快速分离、提纯、制备。,（,i,）聚酰胺薄层板：聚酰胺薄层板一般不需要外加粘合剂，可直接将聚酰胺粉（常用小于,60,目的粉末）制成匀浆制板，欲提高牢度，可加石膏或淀粉。该种板可以反复使用，再生方法为丙酮和浓氨水（,9,：,1,）或丙酮和甲酸（,9,：,1,）浸泡,6h,，洗去污物，再用丙酮洗涤，晾干后即可使用。,18:20:49（g）烧结板：由玻璃粉（作粘合剂）与硅胶或氧,15,11:01:02,（,j,）纤维素薄层板：薄层用短纤维素制成，斑点集中，天然纤维素长,2,25 m,，微晶纤维素,20,40 m,，铺板可用粘合剂。一般用纤维素与水,1,：,5,混匀，铺板，晾干即可，,105,烘干。,（,k,）反相薄层板：原来反相板是用石蜡处理，现在改用化学键合相硅胶和乙酰化纤维素等制备。,（,l,）高效板：使用窄范围的细粒度硅胶或键合相硅胶铺板，常用粒度范围为,5,7m,，厚度一般为,0.2mm,，高效板分离度和灵敏度高，分析速度快。,18:20:49（j）纤维素薄层板：薄层用短纤维素制成，斑点,16,