动物细胞培养的应用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,动物细胞培养的应用,.,表1 动物细胞培养的产物,疫苗,人,小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗等,动物,牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎疫苗、鸡痘病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬疫苗、草鱼出血热疫苗,单克隆抗体,IgG、IgM、IgA等,免疫调节剂,-细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、血清胸腺因子、白细胞介素、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等,酶,尿激酶、天门冬氨酰胺酶、胶原酶、细胞色素P、450、纤维蛋白溶酶原激活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酷氨酸脱羟酶等,激素,绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促滤泡激素、生长激素、促间质细胞激素、促黄体激素等,.,表2 微生物和动物细胞培养方法的比较,微生物细胞,动物细胞,PH控制,添加酸、碱,CO,2,-HCO,3,缓冲液,搅拌速度,速度快、范围广,较慢,溶氧控制,改变搅拌速度、通气量、进气氧浓度,改变进入气体的氧浓度,培养基灭菌方法,高温蒸煮,过滤,培养时间,几小时几天,几天3、4周,对水纯度的要求,较低,很高,与,微生物细胞培养类似，动物细胞的体外培养有两种类型：,一类是非贴壁依赖性细胞，这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养；另一类是贴壁依赖性细胞，它们需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长。,.,5、动物细胞大规模培养工艺,大规模动物细胞培养的工艺流程如图11-15所示。工艺过程中，先将,组织切成碎片,，然后,用溶解蛋白质的酶处理,而得到单个细胞，再用,离心法,收集细胞。将,细胞植入营养培养基,，使细胞在培养基中增殖到覆盖瓶壁表面，用酶把细胞从瓶壁上消化下来，再,接种到若干培养瓶中进行扩大培养,，将培养所得的细胞“种子”,冷藏于液氮中,，从液氮中取出一部分细胞“种子”,进行解冻、复活培养,，进行,扩大培养,以获得足够的细胞量，将细胞接种于大规模生物反应器中进行,大规模培养,，按照产物的不同形式进行,产物分离纯化,。对于积累在细胞内的产物，可通过收集细胞后进行破胞，再经过分离纯化获得产物；对于由细胞分泌到培养液中产物，可以通过浓缩、纯化培养液来获得产品；而对于那些,必须加入诱导剂进行培养或病毒感染培养,才能得到的产物的细胞，可加入上述诱导剂诱导或病毒感染后，收集细胞，再经分离纯化得到产物。,.,图11-15 大规模动物细胞培养工艺流程图,细胞培养反应器,提取,细胞,诱生剂,细胞,产品（肿瘤抗原）,纯化,产品（干扰素）,纯化,提取,产品（单克隆抗体）,浓缩纯化,7,9,8,6,5,4,3,2,1,10,.,内容（一）,单克隆抗体,哺乳动物细胞中有一套复杂的,防御系统,保护自己不受,有毒物质,和,病原物,的侵害，其中一部分防御反应就是,淋巴细胞经诱导产生特异的蛋白,，,这些蛋白可以在其他免疫系统蛋白的帮助下与外来物质结合，并抵消其生物学功能。这些特异的蛋白，就是抗体；相对于抗体，诱发产生抗体的外来物质即称为,抗原,。,抗体最早是由德国微生物学家,贝林,发现的，它们存在于,人和脊椎动物的血清,之中，是这些生物体内免疫系统的重要组成成分。由于抗体分子具有极其精确的结合特异性，可以识别各种不同的抗原，还可以激活细胞的其他防卫系统以,消灭抗原,，因此抗体在基础研究和临床诊断中获得了广泛的重视和应用。随着,杂交瘤技术、蛋白质工程,和,转基因技术,等技术的发展，抗体已逐步在疾病治疗等应用领域显示出越来越广阔的应用前景。,.,抗体,由B细胞产生的免疫球蛋白，它能识别抗原的某一特定位点。,抗体分子由两个完全相同的重链分子以及两个完全相同的轻链分子组成。存在于人或哺乳动物的血清之中。,抗原,指诱导产生抗体的物质。,如前所述，抗体分子是免疫系统反应的一个重要组分，因为抗体分子可以识别各种不同的外来抗原，同时可激活宿主的防卫系统。,对于一个,免疫刺激（,有毒物质或病原物侵入，即抗原,）,，每一个淋巴细胞都会合成并分泌一种单个的抗体，这些抗体可以高度特异地识别免疫抗原的特定区域，也就是,抗原决定簇,。由于一个抗原通常都有几个不同的抗原决定簇，因此每个免疫淋巴细胞都可能产生一种针对某一个抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原而产生的不同的抗体统称为,多克隆抗体,。,有毒物质或病原物侵入，即抗原,侵入,抗体2,抗体1,.,于是，人们认识到要把抗体应用于临床诊断或是治疗，必须要制备单一类型的只对某一特定抗原决定簇的抗体分子，也就是单克隆抗体。,多克隆抗体,在一个血清样品中包含了对同一抗原分子上不同抗原决定簇的多种抗体。,单克隆抗体,由杂交瘤细胞系产生的针对某一特定抗原决定簇的,单一类型的抗体,。,.,补充,要根据糖基化的结构，选择适宜的细胞系糖代谢特点，氨基酸代谢特点，选择适宜的细胞系。,.,细胞系,Fuc,Gal,唾液酸,1,6,1,3 Fuc,1,3Gal,SO,4,-GalNAc,2,3,2,6,糖基化,等分GluNAc,BHK,+,0,+,0,+,0,-,0,CHO,+,-,0,0,+,0,+,0,鼠杂交瘤,+,0,+,0,+,0,+,0,C127,+,0,+,+,+,+,+,0,J558L,+,0,+,-,+,+,+,0,人淋巴细胞,+,0,0,0,+,+,0,+,人垂体,+,0,0,+,+,+,0,+,Namalwa,+,0,0,0,+,+,-,-,人鼠杂交瘤,+,0,0,0,+,+,+,0,.,动物细胞制药的表达系统与特征,昆虫系统、哺乳动物细胞系统，最成功、重要表达活性外源蛋白的有效系统，应用于药物蛋白质的表达。,一、哺乳动物细胞表达系统与特征,1.动物细胞的特征 细胞膜、,细胞质和细胞核，没有细胞壁。亚细胞器，功能独特。,内容（二）,.,2哺乳动物细胞株系,CHO细胞：中国仓鼠卵巢中分离的上皮样细胞系，贴壁型生长，是目前使用最为普遍和成熟的表达糖基化蛋白药物的宿主细胞。核型为亚二倍体，分泌表达外源蛋白，而内源蛋白分泌很少。贴壁型生长细胞，但可进行悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。蛋白质翻译后的修饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。,有多种衍生突变株应用于药物的生产，培养时需要添加脯氨酸。二氢叶酸还原酶缺陷株表达的药物有tPA、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子、DNA酶，已上市。,使用氨甲酰喋呤，增加外源基因的拷贝数，提高蛋白质表达水平。,.,BHK21：幼仓鼠肾脏中分离的成纤维样细胞，非整倍体。用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白。BHK-21表达的重组凝血因子已被获准上市。,C127：从小鼠乳腺肿瘤中分离获得的上皮样细胞，贴壁型生长。C127细胞系已表达多种外源基因，其中EPO的水平达10 mg/L，生产rhGH已被批准上市。,3T3,：,HIN Swiss,小鼠胚胎培养物中分离建立的连续细胞系，能大量表达外源蛋白，广泛用于药物毒理学研究。,骨髓瘤细胞：,J558L,是小鼠,BALB/c,骨髓瘤细胞，分泌,IgA,，用于转染研究。,NSO,和,SP2/O,Ag14,不分泌,Ig,，与淋巴细胞融合筛选杂交瘤，分泌制备特异性抗体。,.,杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞中分离获得杂交瘤细胞系，能在无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生长，能进行糖基化等加工修饰，大量分泌和高效表达。很多杂交瘤细胞系用于抗体的制备。,Vero：从成年非洲绿猴肾中分离获得的贴壁型成纤维细胞，多倍体核型，能适应灌流操作，进行连续培养。已有突变细胞系能用无血清培养。最为常用Vero E6增殖多种病毒，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，已被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。,COS,：是从,SV40 DNA,转化的非洲绿猴肾细胞,CV1,中分离得到的，广泛用于外源基因瞬时表达的研究。,GH3用于生长激素研究，293细胞系用于基因治疗的研究。,.,3昆虫细胞株系,Sf21：从秋粘虫卵巢细胞中分离得到，细胞较大，容易放大，高效表达外源基因。,Sf9：从秋粘虫的卵巢细胞（SF21）中分离得到，是最常用的昆虫表达细胞。对杆状病毒高度敏感，生长快，能高效表达外源基因。抗机械剪切，能在无血清培养基的搅拌反应器中生长。,TN-5B1-4：从粉纹夜蛾卵细胞匀浆中分离得到，无血清培养，快速倍增。分泌表达重组蛋白的能力比Sf9细胞系高20多倍，能适应悬浮培养。,.,三、细胞转染,转染（是将外源基因导入哺乳动物细胞的技术通用名称。基因导入真核细胞的方法很多，主要有化学转染、物理转染和病毒介导的转化。,方法,表达类型,毒性,细胞类型,特点,基因枪,瞬时，稳定,无,多种细胞组织，器官,有效，仪器操作,显微注射,瞬时，稳定,无,多种细胞,有效，技术难度大,电穿孔,瞬时，稳定,无,多种细胞,有效，仪器操作,冲击波,瞬时，稳定,无,多种细胞，局部组织,简单有效，仪器操作,.,方法,表达类型,毒性,细胞类型,特点,逆转录病毒,瞬时，稳定,无,对应的宿主细胞,有效,原生质体融合,瞬时，稳定,无,悬浮细胞,技术复杂,生物转染特点,.,化学转染是最常用的转染方法。,其基本原理是磷酸钙、二乙氨乙基（,DEAE,）葡聚糖（,dextran,）和阳离子树脂与核酸形成复合物，附着于细胞表面，通过细胞的内吞作用进入细胞。,磷酸钙与,DNA,形成不溶性沉淀，带正电荷的,DEAE,葡聚糖与带负电荷的,DNA,磷酸基团结合，阳离子树脂包裹,DNA,形成脂质体。,渗透性休克和,DMSO,等化学试剂能促进,DNA,进入细胞。转染试剂盒商业化供应，特别是脂质体材料的转染试剂。,影响因素：细胞培养物的密度、,DNA,的大小、纯度与用量、化学试剂的用量与处理时间、促进剂的使用等。,.,方法,表达类型,毒性,细胞类型,特点,磷酸钙,瞬时、稳定,无,贴壁细胞，悬浮细胞,简单,DEAE-葡聚糖,瞬时,有,CV1，COS,简单,阳离子树脂,瞬时、稳定,有或无,贴壁、原代悬浮细胞,简单，有效,化学转染的特点,.,四、转染体筛选与分离,转染后16天收获细胞，进行核酸分子杂交或蛋白质杂交，检测外源基因的瞬时表达。,为了获得稳定整合的细胞系，先在非选择性培养基上培养2448小时，让细胞倍增12代，使转染DNA表达。再按1：15比例转移到选择性培养基上，每24天更换培养基，持续23周，促进抗性细胞生长，清除死细胞残骸，最后得到独立的克隆。,在转染中大约有万分之一的细胞将稳定整合外源基因，因此需要显性选择标记来分离转染细胞。,哺乳动物细胞的选择标记，使用与之相对应的选择剂。,.,选择剂,基因,使用浓度,氨甲喋呤,dhfr,0.01300 mol/L,氨喋呤,tk,0.4 mol/L,5-溴脱氧尿苷,tk,30 g/ml,G418,Zeocin,neo,100800 g/ml,潮霉素B,hyg,10400 g/ml,杀瘟稻菌素,bsd,210 g/ml,霉酚酸,gpt,25 g/ml,嘌呤霉素,乙酰基转移酶,0.510 g/ml,Xyl-A,ada,4 mol/L,.,报告基因,特点,使用与分析方法,cat,内源活性低，蛋白稳定，线性范围窄，,体外，荧光或免疫分析,lacZ,有内源活性，X-gal染色，线性范围宽,体内外，染色，比色、化学发光或荧光分析,碱性磷酸酶,分泌型，线性范围宽，受到细胞类型限制,体外，比色、化学发光或荧光分析,gus,蛋白质稳定，线性范围宽，X-Gluc染色,体内外，染色，比色、化学发光或荧光分析,gfp,无内源活性，分子量小，稳定，无需底物，紫外线激发,体内外，荧光分析,.,