实验项目：黄酮提取二

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,实验项目：,木芙蓉花中有效成份提取与性能研究,主讲教师：倪明,一、目的与要求,1了解植物中有效成份的药用价值。,2掌握植物中有效成份的提取及其测定方法。,3掌握抑制亚硝化反应的操作与方法。,二、实验原理与相关知识,黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环（,A-,与,B-,环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为,2-,苯基色原酮。是一大类以苯色酮环为基础的酚类化合物。植物中由苯丙氨酸产生的肉桂酰辅酶,A,，经碳链延长环化生成的查耳酮，再衍生成的各种,-,苯基衍生物。,二、实验原理与相关知识,黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。此外，它还常与糖结合成苷。天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，并且由于糖的种类、数量、联接位置及联接方式不同可以组成各种各样黄酮苷类。组成黄酮苷的糖类包括单糖、双糖、三糖和酰化糖。黄酮苷固体为无定形粉末，其余黄酮类化合物多为结晶性固体。黄酮类化合物不同的颜色为天然色素家族添加了更多色彩。这是由于其母核内形成交叉共轭体系，并通过电子转移、重排，使共轭链延长，因而显现出颜色。黄酮苷一般易溶于水、乙醇、甲醇等极性强的溶剂中；但难溶于或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中。糖链越长则水溶度越大。黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性。酸性强弱因酚羟基数目、位置而异。黄酮类化合物广泛存在于天然产物中，大多具有明显的抗炎、抗菌、生物抗氧化性、抗衰老、降血脂、治疗心血管疾病等功能。其中有些可用于心血管病的治疗。,二、实验原理与相关知识,植物单宁,(Vegetable tannins),，又称植物多酚,(Plant Polyphenol),为多羟基苯，如苯二酚、苯三酚等，是一类广泛存在于植物体内的多元酚化合物。在维管植物中的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素，广泛存在于植物的皮、根、叶、果中，含量可达,20%,。植物单宁是植物的次生代谢产物，属于天然有机化合物。常是植物及微生物中产生的酚类次生代谢产物。具有抗氧化性、抗肿瘤、抗动脉硬化、防冠心病与中风等心脑血管病以及抗菌等多种生理功能，是自然界和人类的“健康卫士”。,2l,世纪随着抗氧化剂理论及研究工作的深入，以及消费者对食品安全性意识的提高，天然抗氧化剂的应用越来越受到人们的重视，回归大自然已是目前一个大趋势。木芙蓉（,Hibiscus mutabilis L.,）为锦葵科植物，又名拒霜花、木莲、醉芙蓉，为落叶灌木或小乔木。其花大色艳，花色一日三变，在寒凉的深秋傲霜怒放，观赏价值极佳。其花、叶、根富含生化药物成分，是极优良的中药材。中医认为，木芙蓉性平味辛，有清热、凉血、解毒、消肿、排毒之功效，适用于肺热咳嗽、月经过多、白带过多、痈疽肿毒、疔疮、水火烫伤等疾病。,本草纲目,言其“治一切大小痈疽，肿毒恶疮，消肿，排脓，止痛”。木芙蓉花、叶中含有多酚、黄酮类化合物。,二、实验原理与相关知识,1.,测定总黄酮的原理,:,在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下,黄酮类化合物先与亚硝酸钠发生氧化还原反应，再加硝酸铝络合，最后加氢氧化钠溶液使黄酮类化合物开环，生成,2-,羟基查耳酮而显红橙色,在,510 nm,波长处有吸收峰且符合定量分析的比尔定律,一般与芦丁标准系列比较定量（它的显色原理发生在黄酮醇类成分邻位无取代的邻二酚羟基部位,不具有邻位无取代邻二酚羟基的黄酮醇类成分加入上述试剂时是不显色的）。,二、实验原理与相关知识,2.,多酚测定原理,:,总多酚的测定采用,Folin-Ciocalteu,法测定总多酚含量，其反应原理为酚类化合物在碱性条件下可以将钨钼酸还原，生成蓝色的化合物，颜色的深浅与酚类化合物含量呈正相关，在波长,760 nm,左右有最大吸收，一般与没食子酸标准系列比较定量。,二、实验原理与相关知识,3.总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定,亚硝酸钠在弱酸性条件下，与对氨基苯磺酸重氮化，然后再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色化合物，用分光光度计测出该化合物的吸光度，就可知道反应液中亚硝酸钠含量多少。据此可以通过测定相同条件下亚硝酸钠含量的变化反映总黄酮清除能力的强弱，亚硝酸钠含量少，总黄酮清除能力就强，反之则弱。,二、实验原理与相关知识,4.,总黄酮对亚硝胺合成阻断率的测定,二甲胺与亚硝酸钠在模拟人体胃液的条件下,(pH 3.0,，温度,37),，可适宜地生成二甲基亚硝胺。当往样品溶液中依次加入二甲胺与亚硝酸钠时，样品溶液优先同亚硝酸钠作用，使得二甲胺不能与亚硝酸钠反应，达到阻止亚硝胺生成的目的。据此可以通过比较相同条件下生成亚硝胺量的多少反映总黄酮阻断能力的强弱，生成亚硝胺量少，总黄酮的阻断能力就强，反之则弱。在紫外灯照射下，二甲基亚硝胺可分解成二甲基仲胺和亚硝酸根，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与,1-,萘胺偶合生成红色化合物，用分光光度计测出该化合物的吸光度，就可知道上述反应液中亚硝胺含量多少。,三、仪仪器与与试剂剂,（一）实实验室提提供下列列仪器和和试剂,1,、仪器：,电子分析析天平；粉碎机机；数显显恒温水水浴锅；三用紫紫外仪；真空泵泵；分光光光度计计；电热热套；比比色管；常用玻玻璃仪器器。,2,、试剂：,木芙蓉花花采自湖湖北师范范学院校校区；芦芦丁（上上海展云云化工有有限公司司）；对对氨基苯苯磺酸（分析纯纯）；柠柠檬酸（分析纯纯）；磷磷酸氢二二钠（分分析纯）；盐酸酸萘乙二二胺（分分析纯）；二甲甲胺（分分析纯）；,1-,萘胺（分分析纯）；钨酸酸钠（分分析纯）；钼酸酸钠（分分析纯）；没食食子酸（分析纯纯）；（分析纯纯）；乙乙醇（分分析纯）；,A1(NO,3,),3,（分析纯纯）；盐盐酸（分分析纯）；,NaOH,（分析纯纯）；浓浓,H,2,SO,4,（分析纯纯）；磷磷酸（分分析纯）。,三、仪器器与试剂剂,（二）学学生自配配及标定定试剂,1,、乙醇溶溶液：,60%,、,80%,乙醇溶液液。,2,、,10%A1(NO,3,),3,溶液。,3,、,1%,三氯化铝铝溶液。,4,、,2,FeCl,3,溶液。,5,、,5%NaNO,2,溶液。,6,、,4%NaOH,溶液；,1%NaOH,溶液。,7,、,5,的醋酸酸铅溶液液。,8,、,1,KMnO,4,溶液。,9,、,10%,、,0.5%Na,2,CO,3,溶液。,10,、,pH3.0,的柠檬酸酸,-,磷酸氢二二钠缓冲冲液磷酸氢二二钠与柠檬酸混混合即可可。,11,、,1 mmol/L,的二甲胺胺溶液。,12,、,1%,、,0.4%,对氨基苯苯磺酸溶溶液。,13,、,0.1%1-,萘胺溶液液。,14,、,0.2%,盐酸萘乙乙二胺溶溶液。,15,、,0.4%,对氨基苯苯磺酸溶溶液。,四、,实验步骤骤,一、,样品的处处理及提提取,1.,处理：新新鲜木芙芙蓉花水水洗后，于,60,烘干，粉粉碎机粉粉碎，过过筛备用用。,2.,提取：精精密称取取干燥、粉碎的的木芙蓉蓉花粉末末,1.0000g,置于锥形形瓶中，加入,60%,乙醇溶液液,30mL,，于,60,浸提,2 h,，滤去残残渣，残残渣洗涤涤,2-3,次，定容容至,100mL,，即得提提取液。,四、,实验步骤骤,二、样品品测定,1.,黄酮测定定,1.1,黄酮类物物质的鉴鉴定方法法,(1),盐酸一镁镁粉反应应：取待待测液,1.0mL,放在测试试瓶中，加入少少许镁粉粉振摇，滴加几几滴浓盐盐酸，观观察反应应现象。,(2),氨水反应应：取待待测液,1.0mL,放在测试试瓶中，滴加几几滴氨水水振摇，观察反反应现象象。,(3),硝酸铝反反应：取取待测液液,1.0mL,放在测试试瓶中，滴加几几滴硝酸酸铝振摇摇，观察察反应现现象。,(4),三氯化铝铝反应：取待测测液,1.0mL,放在测试试瓶中，滴加几几滴,1%,三氯化铝铝振摇，观察反反应现象象。,四、,实验步骤骤,(5),氯化铁反反应：在在试管中中加,1 mL,提取物，再加入入,1.0mL,的,2,FeCl3,，观察反反应现象象。,(6),浓硫酸反反应,:,在样品液液中滴加加少量浓浓,H,2,SO,4,溶液，观观察反应应现象。,(7),碱性试剂剂显色反反应在样样品液中中加入,5%NaNO,2,溶液,;,摇匀，旋旋转,6 min,后，加入入等体积积,10%A1(NO,3,),3,溶液，,6 min,后再加入入,4%NaOH,溶液，混混匀，用用,60%,乙醇稀释释，观察察反应现现象。,(8),与,5,的醋酸酸铅反应应：在,5,的醋酸酸铅溶液液中滴加加数滴提提取物，观察反反应现象象。,(9),与,1,高锰酸酸钾溶液液反应：在试管管中加,1,0 mL 1,KMnO,4,，滴入,3,4,滴提取物物，观察察,KMnO,4,溶液是否否褪色。,(10),与碱性试试剂,(1,NaOH),反应：在在,1 mL,提取物中中加入,0,5 mL,的,1,NaOH,，观察颜颜色变化化。,四、,实验步骤骤,1.2,黄酮类物物质定量量测定,标准曲线线的制备备,精密称取取芦丁对对照品,10mg,，置,50mL,量瓶中，加,80%,乙醇溶解解至刻度度，摇匀匀即得对对照品溶溶液。分分别精密密吸取,1.0mL,，,2.0mL,，,3.0mL,，,4.0mL,和,5.0mL,置于,10mL,比色管管中，各加加,80%,乙醇至至,5mL,，加,5%NaNO2,溶液,0.5mL,，摇匀匀放置置,6min,，再加加,10%A1(NO,3,),3,。溶液液,0.5mL,，摇匀匀，再再放置置,6min,，加,4%NaOH,溶液,4mL,，摇匀匀放置置,15min,，在,510nm,波长处处，以以同法法配制制空白白对照照，测测定吸吸光度度值，得回回归方方程。,1.2.2样样品黄黄酮含含量测测定,精密吸吸取提提取液液1.0mL于10mL比色色管中中，按按“各各加80%乙乙醇至至5mL”起起依法法进行行操作作，同同时精精密吸吸取黄黄酮提提取液液1.0mL于10mL比色色管中中，加加80%乙醇醇至5mL，再加加1mL水水，4mL4%NaOH溶液液，作作样品品空白白测定定吸光光度值值。按按回归归方程程计算算样品品黄酮酮提取取得率率。,四、,实验步步骤,2.,多酚测测定,2.1,福林酚酚（,Folin-Ciocalteu,）试剂剂的配配制,称取,100g,钨酸钠钠和,25g,钼酸钠钠置于于,2L,的磨口口圆底底烧瓶瓶中，用,700mL,蒸馏水水溶解解，再再缓慢慢加入入,50mL85%,的磷酸酸和,100mL,的浓盐盐酸，充分分混匀匀，放放入数数粒玻玻璃珠珠，连连接回回流冷冷凝装装置，文火火回流流,10h,。用,50mL,蒸馏水水冲洗洗冷凝凝管上上的附附着物物，拆拆开冷冷凝管管后加加入,150g,无水硫硫酸锂锂和几几滴溴溴水（边加加边摇摇晃），开开口继继续加加热沸沸腾,15min,，使溴溴水完完全挥挥发为为止，终点点颜色色为黄黄绿色色。冷冷却后后定容容至,1000mL,，过滤滤，储储存于于棕色色瓶中中，放放入冰冰箱中中保存存备用用。,四、,实验步步骤,2.2,制作没没食子子酸标标准曲曲线,精确称称取,0.070g,的干燥燥没食食子酸酸标准准品，用蒸蒸馏水水溶解解，定定容于于,100mL,的容量量瓶中中，配配成浓浓度为为,700mg/L,的没食食子酸酸溶液液。然然后分分别精精密吸吸取,0,、,0.5,、,1.0,、,1.5,、,2.0,、,3.0,和,4.0mL,没食子子酸标标准溶溶液定定容于于,50mL,容量瓶瓶内，配成成浓度度为,0-56mg/L,的系列列标准准溶液液。再再从各各系列列标准准溶液液中吸吸取,1mL,于,25mL,比色管管内，加,10mL,蒸馏水水，摇摇匀，再加加,1.5mLFolin-Ciocalteu,试剂，充分分摇匀匀，立立即加加入,6mL10%Na,2,CO,3,溶液，混匀匀，加加水定定容，再混混匀，然后后在,30,下避光光放置置反应应,2h,，以试试剂样样为空空白，在波波长,7