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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一、光镜技术,光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。,电子显微镜：以电子束为光源。,一、光镜技术光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。,1.,原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。,2.,分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。,R,0.61/,N.A.,为入射光线波长；,N.A.,为镜口率,sin/2,，,n,介质折射率；,镜口角,普通光学显微镜,1.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。普通光,显微镜的几个光学特点：,制作光学镜头所用的玻璃折射率为,1.65,1.78,，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。,sin/2,的最大值必然小于,1,；介质为空气，镜口率一般为,0.05,0.95,；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近,1.5,。,普通光线的波长为,400,700nm,，分辨力数值不会小于,0.2m,，人眼的分辨力为,0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为,1000X,。,显微镜的几个光学特点：,荧光显微镜,特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；,有两个特殊的滤光片；,照明方式通常为落射式。,荧光显微镜特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜,激光共聚焦扫描显微境,用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。,能显示细胞样品的立体结构。,分辨力是普通光学显微镜的,3,倍。,用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。,激光共聚焦扫描显微境 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描,暗视野显微镜,聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。,可观察,4200nm,的微粒子，分辨率比普通显微镜高,50,倍。,暗视野显微镜聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。,环形光阑：位于光源与聚光器之间。,相位板：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟,1/4,。,相差显微镜,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的,微分干涉差显微镜,1952,年，,Nomarski,发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。,微分干涉差显微镜1952年，Nomarski发明，利用两组平,倒置显微镜,物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。,倒置显微镜物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台,二、电子显微镜,透射电子显微镜,TEM,扫描电子显微镜,SEM,二、电子显微镜透射电子显微镜,TEM,以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压,(,通常,50,120KV),的平方根成反比。,由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等,5,部分构成。,分辨力,0.2nm,，放大倍数可达百万倍。,用于观察超微结构，即小于,0.2m,、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构。,1.,原理,（一）透射电子显微镜,以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速,2,、制样技术,1,）超薄切片,电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅,50nm,的超薄切片，用超薄切片机制作。,通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。,2、制样技术1）超薄切片,2,）负染技术,用重金属盐,(,如磷钨酸,),对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达,1.5nm,左右。,Negative Stained Actin,2）负染技术用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；,3,）冰冻蚀刻,freeze-etching,亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（,replica,）。,A Yeast Cell,3）冰冻蚀刻 freeze-etching亦称冰冻断裂。标本,20,世纪,60,年代问世，用来观察标本表面结构。,分辨力为,610nm,，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为,0.2mm,，扫描电镜的有效放大倍率为,0.2mm/10nm=20000X,。,（二）扫描电子显微镜,20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。（二）扫描电子显,（三）扫描隧道显微镜,scanning tunneling microscope,，,STM,原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（,2mV2V,），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。,分辨率：横向为,0.10.2nm,，纵向可达,0.001nm,。,用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。,（三）扫描隧道显微镜scanning tunneling,三、显微操作技术,在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。,显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。,细胞核移植技术已有几十年的历史，,Gordon,等人（,1962,）对非洲爪蟾进行核移植获得成功。我国著名学者童第周等上个世纪,70,年代在鱼类细胞核移植方面进行了许多工作，并取得了丰硕成果。,三、显微操作技术在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期,四、放射自显影术,用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。,原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。,一般用,14,C,和,3,H,标记。常用,3,H-TDR,来显示,DNA,，用,3,H-UDR,显示,RNA,；用,3,H,氨基酸研究蛋白质，用,3,H,甘露糖、,3,H,岩藻糖研究多糖。,14,C,半衰期为,5730,年，,3,H,为,12.5,年。,四、放射自显影术用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布,七、离心技术,是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段。,转速为,1025kr/min,的离心机称为高速离心机。,转速,25kr/min,，离心力,89K,者称为超速离心机。,目前超速离心机的最高转速可达,100000r/min,，离心力超过,500Kg,。,七、离心技术是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种,（一）差速离心,特点：,介质密度均一；,速度由低向高，逐级离心。,用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。,沉降顺序：核,线粒体,溶酶体与过氧化物酶体,内质网与高基体,核蛋白体。,可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。,（一）差速离心特点：,（二）密度梯度离心,用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。,类型：速度沉降、等密度沉降。,常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。,分离活细胞的介质要求：,1,）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；,2,）,PH,中性或易调为中性；,3,）浓度大时渗透压不大；,4,）对细胞无毒。,（二）密度梯度离心用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯,八、细胞融合,通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（,cell fusion,）或细胞杂交。,同核体,：相同基因型的细胞融合而成。,异核体：,不同基因型的细胞融合而成。,自发融合：,同种细胞在培养过程中自发合并的现象。,诱发融合：,异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。,诱导细胞融合的方法：,生物方法,（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒）、,化学方法,（聚乙二醇,PEG,）、,物理方法,（电击和激光）。,八、细胞融合通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多,
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