质粒抽提.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,质 粒 抽 提,陈继胜,质粒的重要性,质粒是宿主细胞引入外源基因的主要方法,!,质粒是下游生物技术,(,如蛋白表达,药物筛选,细胞和组织研究,),的基础,!,质粒的结构影响下游实验的成功率,特别是涉及到蛋白和基因的相互作用时,!,质粒是我们发给客户的最终产品,!,质粒,抽提,的方法,碱裂解法抽提质粒,煮沸法快速提取质粒,碱裂解法抽提质粒的原理,:,在,pH 12.0 12.6,碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体,DNA,变性分开，而共价闭环的质粒,DNA,虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将,pH,调至中性并有高盐条件下，大部分染色体,DNA,、大分子量的,RNA,和蛋白质在去污剂,SDS,的作用下形成沉淀，而质粒,DNA,仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体,DNA,、,RNA,及蛋白质，质粒,DNA,尚在上清中，然后再进一步纯化质粒,DNA,。,首先以,Axygen,小抽试剂盒介绍一下试剂的成分,:,溶液,I:50,mM,葡萄糖,/25,mM,Tris-Cl,/10,mM,EDTA,，,pH 8.0,；,RNAse,;,溶液,II:0.2 N,NaOH,/1%SDS,；,溶液,III:3 M,醋酸钾,/2 M,醋酸,;,Wash solution W1:Proteinse K;,Wash solution W2:,乙醇,;,溶液,I,的作用,首先要控制溶液的,pH,，因此用适当浓度和适当,pH,值的,Tris-Cl,溶液，,50,mM,葡萄糖起到使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积底部。,EDTA,是,Ca2+,和,Mg2+,等二价金属离子的螯合剂,主要作用是：抑制,DNase,的活性。在溶液,I,中加入达,10,mM,的,EDTA,，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。,溶液,II,作用,用新鲜的,0.4N,的,NaOH,和,2,的,SDS,等体积混合后使用的。要新从浓,NaOH,稀释制备,0.4N,的,NaOH,。破细胞的主要是碱，而不是,SDS,，所以才叫碱法抽提。事实上,NaOH,是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从,bilayer,（双层膜）结构向,micelle,（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的,0.4N,NaOH,，即便是有,SDS,也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用,SDS,当然也能抽提得到少量质粒，因为,SDS,也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对,NaOH,的作用误以为是为了让基因组,DNA,变性，以便沉淀。有人不禁要问，既然是,NaOH,溶解的细胞，那为什么要加,SDS,呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组,DNA,片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合,不然基因组,DNA,也会断裂。,溶液,III,溶液,III,加入后就会有大量的沉淀。沉淀是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质还有基因组,DNA,。大家知道,SDS,专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个,SDS,分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基因组,DNA,也一起被共沉淀了。中和后的离心去蛋白,-,一定要将蛋白质彻底离心下去。如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面，继续离心的效果并不好；而将上清倒入另外一个离心管中，再离心，效果要好许多。,氨基化二氧化硅晶体粉末吸附法,由于表面氨基化使纳米颗粒在一定的,pH,环境下的,(zeta,),电位为正值，与带负电荷的质粒,DNA,通过静电结合能快速形成纳米颗粒,-,质粒,DNA,复合物，并对结合的,DNA,有明显的保护作用,苯酚,/,氯仿分离蛋白质和核酸法,按氯仿,:,异戊醇,24:1,体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。,按体积,/,体积,1:1,混合上述饱和酚与氯仿即得酚,/,氯仿,(1:1),。,苯酚,/,氯仿分离蛋白质和核酸法,1.,加等量的酚,/,氯仿混合液振荡混匀，离心,12000 rpm,，,5min,。,2.,取上层溶液至另一管，加入等体积的酚,/,氯仿混合液，振荡混匀，离心,12000 rpm,，,5min,。,3.,取上层溶液至另一管，加入,2,倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀,2min,，离心,12000 rpm,10min,。,4.,小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。,5.,用,1ml 70%,乙醇洗涤沉淀物,1,次，离心,12000 rpm,，,5min,。,6.,小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。,7.,加,200ul TE,重新溶解沉淀物，然后置于,4,或,?C20,保存备用。,8.,吸取适量样品于,GeneQuant,上检测浓度和纯度。,酚和氯仿的各自作用,酚（,Phenol,）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚,/,氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚,/,氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收,!,乙醇沉淀,DNA,回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入,2,倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒,DNA,沉淀出来。,乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对,DNA,很安全，因此是理想的沉淀剂。,DNA,溶液是,DNA,以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去,DNA,周围的水分子，使,DNA,失水而易于聚合。,煮沸法快速提取质粒,主要溶剂,（,1,）,STET,缓冲液（,pH8.0,）（,8%,蔗糖，,0.5%Triton,50mmol/L EDTA,10mmol/L,Tris,）,（,2,）,5%CTAB,（十六烷基三甲基溴化氨）,（,3,）,溶菌酶（,50mg/ml,，溶于,10mmol/L,Tris-HCl,，,pH 8.0,）,主要步骤,:,（,1,）弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将细菌沉淀物悬浮于,200 m l STET,缓冲液，用涡旋混合器充分混匀。（,2,）加入,4 m l,新鲜配制的溶菌酶液，混匀，置室温下,5min,。（,3,）用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时,45,秒，取出后立刻离心,10min,。（,4,）用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入,8 m l 5%CTAB,，用混合器混匀后，高速离心,5min,，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体。,主要步骤,:,（,7,）加入,1.2M,氯化钠,300 m l,，充分溶解沉淀物，再加入,750 m l,的冷乙醇，充分混匀后，离心,15min,，弃上清液。（,8,）取,1ml 70%,冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，离心,5min,。弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥,5-10min,。（,9,）沉淀物溶于,50 m l TE,缓冲液中，混合器混匀。（,10,）即成质粒制备液,煮沸法与碱裂解法比较,煮沸法最大的优点就是不会使基因组,DNA,发生断裂,抽出来的质粒带型比碱裂解法抽出来的单一,碱裂解法作用剧烈对蛋白处理比较彻底,操作简单,质粒的检测,判断质粒抽提好坏的标准,:,1.,吸光值检测：采用生物分光光度计检测,260nm,、,280nm,波长吸光值，若吸光值,260nm/280nm,的比值介于,1.7,1.9,之间，说明质粒质量较好，,1.8,为最佳，低于,1.8,说明有蛋白质污染，大于,1.8,说明有,RNA,污染。,质粒的检测,2.,电泳检测,:,标准质粒电泳检测图应该有三条,带,:,跑最快的是超螺旋，质粒是超螺旋的，电泳的时候最亮很正常；中间的是开环质粒（由于在提取质粒中物理机械力把质粒打断了）；最后是质粒的复制中间体（即没有完全复制的,2,个质粒连在一起）。,质粒的大量制备,Anion-exchange-based QIAGEN-tips yield,transfection,grand DNA,which is highly suited for use in a broad variety of demanding applications such as,transfection,in vitro transcription and translation and enzymatic modifications.,Buffer QBT:750Mm,NaCl,50MmMOPS(free acid),0.15%tritionX-100,15%ISOPROPANOL,Buffer QC:1.0M,NaCl,50MmMOPS,15%ISOPROPANOL,Buffer QF:1.25M,NaCl,50MmTris.cl,15%ISOPROPANOL,Buffer QN:1.6 M,NaCl,50MmMOPS,15%ISOPROPANOL,在装柱过程中,要防止柱床中出现断裂或气泡现象,要使界面保持平整。对新装成的柱,应用含,0.1%SDS,的,TE,平衡,以使柱内的凝胶均匀,细菌内毒素,细菌内毒素,(,Endotoxin,),是革兰氏阴性菌细胞壁上特有的,它主要成分是脂多糖中的类脂,A,。,DNA,溶液中污染的内毒素是造成原代培养细胞转染效率低下的一个重要原因。该试剂盒结合快速吸附质粒抽提系列和特异性的去除内毒素的溶液,能彻底去除内毒素。纯化的质粒内毒素,0.1EU/,ug,。,讨论,:,RNAse,