实验专题模块五-RNA的提取及定量PCR检测技术培训ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,精,*,实验专题模块五,RNA,的提取及定量,PCR,检测技术,总,RNA,的提取,反转录,实时荧光定量,PCR,精,1,实验专题模块五 RNA的提取及定量PCR检测技术总RNA的,RNA,是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对,RNA,进行操作在分子生物学中占有重要地位。,获得高纯度和完整的,RNA,是很多分子生物学实验所必需的，如,cDNA,合成、定量,PCR,、,Northern,杂交及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于,RNA,的质量。,RNA,中,rRNA,的数量最多，占总量的,80%,85%,；,tRNA,及核内小分子,RNA,占,15%,20%,；,mRNA,仅占,1%,5%,。从基因克隆、表达与诊断的目的出发，目前对,RNA,的分离与纯化，主要集中在总,RNA,与,mRNA,上。,精,2,RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA进,在所有,RNA,实验中，最关键的因素是分离得到全长的,RNA,。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（,RNA,酶）的污染。由于,RNA,酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而,RNA,制剂中只要存在少量的,RNA,酶就会引起,RNA,在制备与分析过程中的降解，而所制备的,RNA,的纯度和完整性又可直接影响后续,RNA,分析的结果，所以,RNA,的制备与分析操作难度相对较大。在实验中，一方面要最大限度地,抑制内源性的,RNA,酶,；另一方面要严格,控制外源性,RNA,酶的污染,。,精,3,在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全,注意与要求：,RNA,操作应在专门的区域进行，离心机、移液枪、试剂等均应专用。,操作过程中应自始至终佩戴一次性橡胶或乳胶手套，以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的,RNA,酶带入试管或污染用具。,实验使用枪头、离心管等塑料制品需均经由,0.1%,焦碳酸二乙酯（,DEPC,）的水溶液浸泡过夜，然后灭菌，烘干。所有玻璃制品都必须在,180,烘烤,2,小时。尽量避免与其它实验共享器具，以防止交叉污染。,配制溶液用的酒精，异丙醇等应使用,RNA,实验专用的试剂。,精,4,注意与要求：精4,提取获得的组织或细胞中的总,RNA,，以其中的,mRNA,作为模板，采用,Oligo,（,dT,）或随机引物，即可以利用逆转录酶进一步反转录成,cDNA,。再以,cDNA,为模板进行,PCR,扩增，从而获得目的基因或检测目的基因的表达。,鉴于基因表达差异分析在临床实践中的广泛应用，本模块主要以食管癌细胞中目标基因如,LCN2(lipocalin 2),转录表达水平的定量检测为例，旨在使学生能够系统地理解,RNA,提取、反转录和实时荧光定量,PCR,检测过程，熟练使用有关仪器和软件，掌握基本操作和分析过程，并学会运用相关的实验技术与方法，利用网上的分子生物学信息资源，独立设计出相关解决方案，并能够评价与实施这一方案。,精,5,提取获得的组织或细胞中的总RNA，以其中的m,实验一 总,RNA,的提取,一、实验目的,1.,了解并掌握总,RNA,提取的基本原理。,2.,熟悉,TRIzol,法提取细胞总,RNA,的具体操作过程。,精,6,实验一 总RNA的提取精6,二、实验原理,总,RNA,的提取围绕着一条主线，即保护,RNA,的完整性，使,RNA,免受,RNase,的酶解。围绕这条主线，要关注,RNase-Free,工作环境的建立、反应中,RNase-Free,条件的保持、,RNA,的保存等一系列细节问题。所有,RNA,的提取过程中都有五个关键点，即,1,）样品细胞或组织的有效破碎；,2,）有效地使核蛋白复合体变性；,3,）对内源,RNA,酶的有效抑制；,4,）有效地将,RNA,从,DNA,和蛋白混合物中分离；,5,）对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。,精,7,二、实验原理 总RNA的提取围绕着一条主线，即,TRIzol,试剂提取总,RNA,该法是,(,异,),硫氰酸胍,-,酚氯仿一步法的改进方法，其产率与,(,异,),硫氰酸胍,-,酚氯仿一步法相当。它是以,(,异,),硫氰酸胍,-,酚的单相裂解试剂裂解细胞。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚而得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制,RNA,酶活性，因此,TRIzol,中还加入了,8-,羟基喹啉、,-,巯基乙醇等来抑制内源和外源,RNase,。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，变性的,DNA,与蛋白质位于两相的界面，保留于上层水相的,RNA,在,RNA,沉淀溶液中通过异丙醇沉淀与,75%,的乙醇洗涤进行制备。,Trizol,试剂可用于小量样品（,50100mg,组织、,510,6,细胞）也适用于大量样品（,1g,组织、,10,7,细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。,精,8,TRIzol试剂提取总RNA精8,三、实验操作,1.,样品处理：,a,单层培养细胞：,细胞接种在,12,孔培养板中,，待细胞满度达,90%,以上或成融合状态时，弃去培养基，用,1ml,枪头将剩余培养基吸干，每个孔直接加入,500,l,的,TRIzol,试剂裂解细胞（每,10cm,2,面积加,1ml,试剂,）将培养板放在三维迷你摇床上，室温（,15-30,）下充分裂解，至少需,5,分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。将裂解液转移至,1.5ml,离心管中。,（,注：加,TRIzol,之前勿需洗涤细胞。,TRIzol,的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。,TRIzol,加量不足可能导致提取的,RNA,有基因组,DNA,污染。,）,精,9,1.样品处理：精9,2.,每使用,1ml TRIzol,加入,0.2ml,氯仿,，剧烈振荡,15,秒，室温放置,3,分钟。,3.4,下，,11000g,离心,15,分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。,RNA,主要在水相中，水相体积约为所用,TRIzol,试剂的,60,。,4.,把水相转移到新管中，加入,0.5ml,异丙醇（,1ml TRIzol,的用量,），充分混匀后，室温放置,10,分钟，以沉淀水相中的,RNA,。,5.4,下，,11000g,离心,10,分钟，离心前看不出,RNA,沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。弃去上清。,6.,用,75,乙醇洗涤,RNA,沉淀。每使用,1ml TRIzol,至少加,1ml 75,乙醇,。,4,不超过,7500g,离心,5,分钟，弃上清，将离心管倒置在吸水纸上，让残留乙醇挥发，时间约为,5,分钟。,（,注意不要完全晾干，否则会导致,RNA,的溶解性降低,）,精,10,2.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡,7.,加入,10l DEPC,水，盖紧盖子，轻弹管底，使,RNA,沉淀充分溶解，冰上放置,10,分钟。,8.RNA,含量测定：紫外分光光度法测量所提,RNA,的浓度与纯度，并登记在实验记录本上。剩余,RNA,保存于,-80C,冰箱中，备用。,注：,RNA,在,260nm,波长处有最大的吸收峰。因此，可以用,260nm,波长分光测定,RNA,浓度，,OD,值为,1,相当于大约,40g/ml,的单链,RNA,。如用,1cm,光径，用,DEPC,水稀释,DNA,样品,n,倍并以,DEPC,水为空白对照，根据此时读出的,OD260,值即可计算出样品稀释前的浓度：,RNA,（,mg/ml,）,=40OD260,读数,稀释倍数,(n)/1000,（,RNA,纯品的,OD260/OD280,的比值为,2.0,，故根据,OD260/OD280,的比值可以估计,RNA,的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质和基因组,DNA,污染；比值太高，则提示,RNA,有降解）,精,11,7.加入10l DEPC水，盖紧盖子，轻弹管底，使RNA,实验二 反转录,一、实验目的,了解并掌握,cDNA,合成的基本原理及其具体操作过程。,精,12,实验二 反转录精12,二、实验原理,反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使,RNA,，并以之为模板人工合成,DNA,的过程。反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖,RNA,的,DNA,聚合酶（,RDDP,），即以,RNA,为模板催化,DNA,链的合成。合成的,DNA,链称为与,RNA,互补,DNA,（,cDNA,）。反转录酶存在于一些,RNA,病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒（,HIV,）也是一种,RNA,病毒，含有反转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有反转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。,精,13,二、实验原理 反转录是进行基因工程过程中，人为,大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。,DNA,聚合酶活性,：以,RNA,为模板，催化,dNTP,聚合成,DNA,的过程。此酶需要,RNA,为引物，多为色氨酸的,tRNA,，在引物,tRNA3,末端以,53,方向合成,DNA,。反转录酶中不具有,35,外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的,DNA,出错率比较高。,RNase H,活性,：由反转录酶催化合成的,cDNA,与模板,RNA,形成的杂交分子，将由,RNase H,从,RNA 5,端水解掉,RNA,分子。,DNA,指导的,DNA,聚合酶活性,：以反转录合成的第一条,DNA,单链为模板，以,dNTP,为底物，再合成第二条,DNA,分子。,精,14,大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下,反转录反应使用反转录酶，以随机引物、,Oligo(dT),或基因特异性的引物起始。对于短的不具有发卡结构的真核细胞,mRNA,，三种引物都可采用。随机引物适用于任何类型的,RNA,模板，但由于特异性低，主要用于单一模板的,RT-PCR,反应。用此种方法时，体系中所有,RNA,分子全部充当了,cDNA,第一链模板，通常用此引物合成的,cDNA,中,96%,来源于,rRNA,。,Oligo(dT),只适用于具有,PolyA,尾巴的,RNA,，对无,PolyA,尾巴的原核生物的,RNA,、真核生物的,rRNA,、,tRNA,以及某些种类的真核生物的,mRNA,不适用。由于,PolyA RNA,仅占总,RNA,的,1-4%,，故此种引物合成的,cDNA,比随机六聚体作为引物得到的,cDNA,在数量和复杂性方面均要小。基因特异性引物是根据模板序列设计的互补引物，特异性好，但仅适用于目的序列已知的情况。,精,15,反转录反应使用反转录酶，以随机引物、Olig,cDNA,合成的模板可以是总,RNA,、,mRNA,或体外转录的,RNA,产物，无论使用何种,RNA,，关键是确保,RNA,中无基因组,DNA,的污染。目前试剂公司有多种,cDNA,第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。本实验将以,TaKaRa,公司提供的,PrimeScript RT reagent Kit,试剂盒（,Code No.RR037A,）为例进行介绍。,精,16,cDNA合成的模板可以是总RNA、mRNA或,精,17,精17,精,18,精18,三、实验操作,*1,：,Oligo dT Primer,和,Random 6 mers,同时使用，可有效将全长,mRNA,反转录成,cDNA.,*2,：,10,l,反转录反应体系可最大使用,500n,g,的,Total RNA,。,1.,反转录反应体系配制：按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数,+1,的量配制,Master Mix,，然后再分装到每个反应管中，最后加入,RNA,样品。轻柔混匀后立即进行反转录反应。,精,19,*1：Oligo dT Primer和Random 6 me,2.,反应条件,(,注：上述