链球菌、肠球菌

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,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实 验 五,链球菌及肠球菌的鉴定,目的要求:,1.,掌握链球菌属及肠球菌属的分离培养与鉴定方法。,2.,掌握链球菌及链球菌的菌落特点、菌体形态及染色性。,步骤与方法,1,、观察菌落,将菌株接种于血琼脂平板上,,35,孵育,18-24h,后观察菌落,记录菌落大小、形态、表面、边缘、透明及颜色、有无溶血及特点。将肺炎链球菌继续孵育,2-3,天看菌落中心有无凹陷呈,“,脐状,”,。,链球菌的溶血性,溶血性链球菌,2,、形态观察,涂片、革兰氏染色镜检,记录镜下细菌染色性、大小、形态、排列及荚膜。,肺炎链球菌,S.pneumoniae,形态与染色:,G,+,球菌,矛头状,成双排列,宽端相对,,尖端向外,有荚膜,肺炎链球菌革兰染色有荚膜,肺炎链球菌荚膜染色特点,肺炎链球菌,S.pneumoniae,培养特性:,营养要求高,兼性厌氧。初次分离需提供,5%-10%,的,CO,2,。,18-24h,后血平板上形成灰白色、圆形、针尖样的菌落。菌落周围有草绿色溶血环。,肺炎链球菌,S.pneumoniae,培养特性:,培养,48h,后,菌落有自溶现象,菌落的中心会出现凹陷,像,“,肚脐,”,称脐状凹陷。,肺炎链球菌,S.pneumoniae,主要生化反应,optochin,试验,:,含,5,g,optochin,纸片贴于 涂布有待测菌的平板上,35,孵育过夜,抑菌圈大于,14mm,即为敏感。,甲型溶血链球菌,(R),肺炎链球菌,(S),胆汁溶菌试验,原理:胆汁或胆盐能活化肺炎链球菌的自溶酶,促进细菌细胞膜破损或菌体裂解而自溶。,方法:,A,、平板法:在血琼脂平板上选择出待检的草绿色溶血的菌落,观察记录菌落特点,然后于菌落上加一滴去氧胆酸钠溶液,,35,孵育,15-30min,观察结果。,B,、试管法:将甲型链球菌和肺炎链球菌血清肉汤培养液,1ml,分别加入,2,支试管,再于各管中加入去氧胆酸钠溶液,0.1ml,,摇匀后置于,37,水浴,30min,后观察结果。,结果判断:平板法若菌落消失为阳性,不消失为阴性,试管法若液体由浑浊变透明为阳性,不透明为阴性,此试验是鉴别甲型溶血性链球菌和肺炎链球菌的重要试验,后者阳性。,痰标本肺炎链球菌革兰染色,A,群,(,化脓性,),链球菌,生物学性状,球形或椭圆形,,,链状排列,革兰染色阳性,(,G,),,,无芽胞,无鞭毛,透明质酸的荚膜。,1.,形态与染色,化脓性链球菌,A,群,(,化脓性,),链球菌,生物学性状,营养要求高,:,血平板或含血清培养基,;,液体培养为沉淀生长,;,血平板呈灰白色表面光滑小菌落,不同,菌株溶血不一,,,多数有透明溶血环,(,b,溶血现象,),。,2,.,培养特性,杆菌肽敏感试验,原理:,A,群化脓性链球菌对杆菌肽几乎,100%,敏感,而其他链球菌对杆菌肽通常耐药。,方法:挑取被检菌落,密涂于血琼脂平板上,将杆菌肽纸片(,0.04U/,片)贴于平板上,,35,孵育,18-24h,观察。,结果判断:出现抑菌环为敏感,推断为,A,群化脓性链球菌。,B,化脓性链球菌杆菌肽阳性,B,群无乳链球菌,CAMP,试验,原理:,B,群溶血性链球菌能产生,CAMP,因子,该物质可促进金黄色葡萄球菌,溶血素的活性,故在血琼脂平板上两菌交界处溶血能力增强,形成箭头状透明溶血区。,方法:在羊血琼脂平板上,用金黄色葡萄球菌划种一条横线,在将被检菌距金葡菌接种线,3mm,处直角接种一短线,,35,培养,18-24h,观察结果。同时设阳性对照和阴性对照。,结果报告:,在两种细菌划线的交接处出现箭头型透明溶血区为阳性,否则为阴性,此试验为,B,群链球菌与其他链球菌鉴别的重要试验,无乳链球菌为阳性,其他为阴性。,无乳链球菌,CAMP,试验阳性,CAMP,阳性,马尿酸水解试验,原理:,B,群链球菌有马尿酸水解酶,可水解马尿酸为苯甲酸和甘氨酸,苯甲酸可与,FeCl,3,,,结合形成苯甲酸铁沉淀。,方法:取待检菌纯培养物接种于马尿酸钠培养基,,35,培养,48h,,,3000r/min,离心,30min,吸取上清液,0.8ml,于另一试管,加入,FeCl,3,0.2ml,,立即混匀,,10-15min,观察结果。,结果:出现恒定沉淀物为阳性。,3,、生化反应,1,)触酶试验:,链球菌属为阴性。,(,6,)血清学试验(链球菌快速分群乳胶凝集试验),原理:,Lancefield,根据链球菌细胞壁中多糖抗原的不同,将链球菌分为,20,多个群,对人类治病的多数为,A,群,偶见,B,、,C,、,D,、,F,、,G,群。用这,6,群抗原的兔免疫血清分别致敏的乳胶颗粒,与具有相应群特异性抗原的链球菌发生间接乳胶凝集反应,可在,10min,内对链球菌作出主要的分群鉴定。,方法:,挑取菌落,2-3,个转种于含有提取酶的试管中,使其成为乳化均匀的菌悬液,置,37,水浴,15min,。在卡片的相应区域滴加一滴,A,、,B,、,C,、,D,、,F,、,G,致敏胶乳,再加入处理后的菌悬液一滴分别与胶乳混匀,同时在卡片相应区域加一滴控制液与任意一滴致敏乳胶混匀,作为阳性对照,轻摇卡片,观察结果。,结果判断:在,2-10min,内发生胶乳凝集,为阳性。待检菌与哪群致敏胶乳凝集就表明该菌为相应血清群的链球菌。,Lancefield,血清凝集分型,(,7,)胶乳凝集试验:,原理:抗链球菌溶血素,“,O,”,(,ASO,)高滴度的病人血清被适量的溶血素,“,O,”,中和后,失去了正常水平量的抗体,多余抗,“,O,”,抗体与,ASO,胶乳试剂反应,出现清晰、均匀的凝集颗粒。,方法:先将病人血清,5630min,灭活,然后用生理盐水做,1,:,15,稀释。在反应板个空内分别滴加稀释血清、阳性和阴性对照血清,1,滴(,50ul,),再于各孔内滴加,1,滴溶血素,“,O,”,溶液,轻摇,1min,混匀,最后在各孔内分别滴加,1,滴,ASO,胶乳试剂,轻摇,3min,后观察结果。,结果判断:出现凝集为阳性、不凝集为阴性。,ASO,阳性可认为患者近期受溶血性链球菌感染过,可辅助诊断风湿热、肾小球肾炎等疾病。,肠球菌属,步骤和方法,1,、菌落观察,:,将菌株接种于血琼脂平板上,,35,孵育,18-24h,后观察菌落,肠球菌在血琼脂平板上呈灰白色、不透明、表面光滑的小菌落,菌落周围可出现,溶血环,也可无溶血环。,2,、形态观察,涂片、革兰氏染色镜检,记录镜下细菌染色性、大小、形态及排列。,肠球菌形态类似链球菌,为单个、成双或短链状排列的卵圆形革兰氏阳性球菌。,3,、生化反应:,(,1,)触酶试验:肠球菌属为阴性反应。,(,2,)胆汁,-,七叶苷试验:,原理:培养基的胆汁对某些细菌有抑制作用,只有既能在胆汁中生长,又能水解七叶苷的细菌才能表现出对七叶苷的水解活性。肠球菌能在胆汁中生长,并水解七叶苷,使培养基变黑。,方法:将被检菌,13,个菌落接种于胆汁,-,七叶苷琼脂培养基,,35,孵育,1824h,。,结果:细菌生长,且培养基变黑色或棕褐色为阳性,不变色为阴性。肠球菌为阳性。,(,3,),65g/L NaCl,生长试验:,原理:肠球菌有很强的耐盐能力,能在,65g/L NaCl,血清肉汤培养基中生长,而链球菌的耐盐能力较弱,在此培养基中不能生长。,方法:将待检菌接种,65g/L NaCl,血清肉汤中,,35,孵育,18-24h,。,结果:细菌生长且使得培养基变黄为阳性,不生长为阴性,肠球菌为阳性。,(,3,),PYR,试验:,原理:多数肠球菌含有吡咯烷酮芳基酰胺酶,能水解吡咯烷酮,-,-,萘基酰胺(,PYR,),释放出,-,萘基酰胺,与,PYR,试剂作用形成红色复合物。,方法:挑取被检菌落在含有,PYR,的纸片上涂擦,,35,孵育,5min,,再于纸片上滴加,PYR,试剂,观察纸片颜色。,结果:约,1min,后纸片呈红色为阳性,不变色为阴性。肠球菌、,A,群链球菌和某些凝固酶阴性的葡萄球菌为阳性。,
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