基因诊疗和基因治疗

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目录,目录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物化学与分子生物学,基因诊疗和基因治疗,第1页,第二十五章,基因诊疗和基因治疗,Gene Diagnosis and Gene Therapy,基因诊疗和基因治疗,第2页,第一节,基 因 诊 断,Gene Diagnosis,基因诊疗和基因治疗,第3页,基因诊疗优势：,可在源头上识别基因正常是否，属于“病因诊疗”,针对特定基因，特异性强,所用,PCR,等技术含有放大效应，故灵敏度高,适用性强，诊疗范围广,是指利用分子生物学技术和方法直接检测基因结构及其表示水平是否正常，从而对疾病作出诊疗方法。,基因诊疗定义：,基因诊疗和基因治疗,第4页,、基因诊疗主要对象和样品起源,主要是,DNA,分子，包括到功效分析时，还可定量检测,RNA,（主要是,mRNA,）和蛋白质等分子。,临床上可用于基因诊疗样品有血液、组织块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液等。,对象：,样品起源：,基因诊疗和基因治疗,第5页,二、基因诊疗技术,分类,定性分析,定量分析,基因分型,检测基因突变,测定基因拷贝数,测定基因表示产物量,基本流程：,基因诊疗基础,核酸抽提,目标序列扩增,分子杂交,信号检测,核酸分子杂交,DNA,序列分析技术,几个技术联合使用,基因诊疗和基因治疗,第6页,（一）基因缺失或插入诊疗,1,DNA,印迹法,其能够区分正常和突变样品基因型，并可取得基因缺失或插入片段大小等信息。,DNA,印迹普通能够显示,50 bp,20 kbp,DNA,片段，片段大小信息是该技术诊疗基因缺点主要依据。,2,PCR,法,裂口,PCR,（,gap-PCR,），简便灵敏而更适合用于临床诊疗。该方法思绪是：设计并合成一组序列上跨越突变（缺失或插入）断裂点引物，从扩增片段大小直接判断是否存在缺失或插入突变。,基因诊疗和基因治疗,第7页,（二）基因点突变诊疗,1,等位基因特异性寡核苷酸分子杂交,检测点突变有效技术是等位基因特异性寡核苷酸（,allele specific oligonucleotide,，,ASO,）分子杂交。,基因诊疗和基因治疗,第8页,2,反向点杂交,反向点杂交（,reverse dot blot,，,RDB,）是改进,ASO,技术。一次检测能够同时筛查各种突变，大大提升了基因诊疗效率。,3,变性高效液相色谱,DHPLC,技术基本原理是利用待测样品,DNA,在,PCR,扩增过程单链产物能够随机与互补链相结合而形成双链特征，依据最终产物中是否出现异源双链来判断待测样品中是否存在点突变。,4,DNA,序列分析,用于基因突变类型已经明确遗传病诊疗及产前诊疗。,基因诊疗和基因治疗,第9页,三、基因诊疗医学应用,（一）遗传性疾病诊疗和风险预测,基因诊疗当前可用于,遗传筛查,和,产前诊疗,。,疾病,致病基因,突变类型,诊疗方法,地中海贫血,珠蛋白,缺失为主,Gap-PCR,、,DNA,杂交、,DHPLC,地中海贫血,珠蛋白,点突变为主,反向点杂交、,DHPLC,甲型血友病,凝血因子,点突变为主,PCR-RFLP,乙型血友病,凝血因子,点突变、缺失等,PCR-STR,连锁分析,苯丙酮尿症,苯丙氨酸羟化酶,点突变,PCR-STR,连锁分析、,ASO,分子杂交,马凡综合症,原纤蛋白,点突变、缺失,PCR-VNTR,连锁分析、,DHPLC,我国部分代表性常见单基因遗传病基因诊疗,基因诊疗和基因治疗,第10页,（二）多基因常见病预测性诊疗,预测性诊疗可为被测者提供一些疾病发生风险评定意见。,（三）传染病病原体检测,适用情况,病原微生物现场快速检测，确定感染源；,病毒或致病菌快速分型，明确致病性或药品敏感性；,需要复杂分离培养条件，或当前尚不能体外培养病原微生物判定。,基因诊疗和基因治疗,第11页,（四）疗效评价和用药指导,PCR,等基因诊疗技术已成为临床上检测和跟踪微小残留病灶常规方法。,在系统说明人类药品代谢酶类及其它相关蛋白编码基因遗传多态性基础上，经过对不一样药品代谢基因靶点药品遗传学检测，将为真正实现个体化用药提供技术支撑。,基因诊疗和基因治疗,第12页,（五）,DNA,指纹判定是法医学个体识别关键技术,人与人之间一些,DNA,序列特征含有高度个体特异性和终生稳定性，正如人指纹普通，故称为,DNA,指纹,（,DNA fingerprinting,）。,STR,等位基因在家庭中遗传示意图,基因诊疗和基因治疗,第13页,第二节,基 因 治 疗,Gene Therapy,基因诊疗和基因治疗,第14页,是以改变人遗传物质为基础生物医学治疗，即经过一定方式将人正常基因或有治疗作用,DNA,片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因治疗方法。它针正确是,疾病根源,，即异常基因本身。,基因治疗定义,基因诊疗和基因治疗,第15页,一、基因治疗基本策略,（一）缺点基因准确原位修复,基因矫正,gene correction,基因置换,gene replacement,致病基因突变碱基进行纠正,用正常基因经过重组原位替换致病基因,这两种方法属于对缺点基因准确原位修复，既不破坏整个基因组结构，又可到达治疗疾病目标，是最为理想治疗方法。,基因诊疗和基因治疗,第16页,（二）基因增补,不删除突变致病基因，而在基因组某一位点额外插入正常基因，在体内表示出功效正常蛋白质，到达治疗疾病目标。这种对基因进行异位替换方法称为,基因添加,（,gene augmentation,）或称,基因增补,，,是当前临床上使用主要基因治疗策略,。,基因诊疗和基因治疗,第17页,（三）基因缄默或失活,有些疾病是因为某一或一些基因过分表示引发，向患者体内导入有抑制基因表示作用核酸，如反义,RNA,、核酶、干扰小,RNA,等，可降解对应,mRNA,或抑制其翻译，阻断致病基因异常表示，从而到达治疗疾病目标。这一策略称为,基因失活,（,gene inactivation,）或,基因缄默,（,gene silencing,）。,基因诊疗和基因治疗,第18页,二、基因治疗基本程序,基因治疗基本过程,可分为,5,个步骤：,选择治疗基因,选择携带治疗基因载体,选择基因治疗靶细胞,在细胞和整体水平导入治疗基因,治疗基因表示检测,基因诊疗和基因治疗,第19页,（一）选择治疗基因,许多分泌性蛋白质如生长因子、多肽类激素、细胞因子、可溶性受体（人工构建去除膜结合特征受体），以及非分泌性蛋白质如受体、酶、转录因子正常基因都可作为治疗基因。简言之，只要清楚引发某种疾病突变基因是什么，就可用其对应正常基因或经改造基因作为治疗基因。,基因诊疗和基因治疗,第20页,（二）选择携带治疗基因载体,基因治疗用载体有,病毒载体,和,非病毒载体,两大类，多项选择取病毒载体。,野生型病毒必须经过改造，剔除其复制必需基因和致病基因，消除其感染和致病能力。,当前用作基因转移载体病毒有,逆转录病毒,（,retrovirus,）、,腺病毒,（,adenovirus,）、,腺相关病毒,（,adeno-associated virus,AAV,）、,单纯疱疹病毒,（,herpes simplex virus,，,HSV,）等。,基因诊疗和基因治疗,第21页,1.,逆转录病毒载体,逆转录病毒属于,RNA,病毒，其基因组中有编码逆转录酶和整合酶（,integrase,）基因。,逆转录病毒载体有基因转移效率高、细胞宿主范围较广泛、,DNA,整合效率高等,优点,。,缺点,一是有感染性病毒可能；二是增加了肿瘤发生机会。,基因诊疗和基因治疗,第22页,2.,腺病毒载体,腺病毒属,DNA,病毒，可引发人上呼吸道和眼部上皮细胞感染。,安全性高,转染效率高,可用细胞范围广,缺点,基因组较大，构建复杂,不能长久表示,免疫原性较强，易被排斥,优点,基因诊疗和基因治疗,第23页,（三）选择基因治疗靶细胞,靶细胞通常是,体细胞,（,somatic cell,），包含病变组织细胞或正常免疫功效细胞。,1.,造血干细胞,：,造血干细胞（,hematopoietic stem cell,，,HSC,）是骨髓中含有高度自我更新能力细胞，能深入分化为其它血细胞，并能保持基因组,DNA,稳定。,2.,皮肤成纤维细胞,：,皮肤成纤维细胞含有易采集、可在体外扩增培养、易于移植等优点。,3.,肌细胞,：,肌细胞有特殊,T,管系统利于注射质粒,DNA,经内吞作用进入。环状质粒不整合入基因组,DNA,，能在肌细胞内较长时间保留。,基因诊疗和基因治疗,第24页,（四）将治疗基因导入人体,将外源基因直接注入体内相关组织器官，使其进入对应细胞并进行表示。,基因递送,gene delivery,间接体内疗法,ex vivo,直接体内疗法,in vivo,将需要接收基因靶细胞从体内取出，在体外培养，将携带有治疗基因载体导入细胞内，筛选出接收了治疗基因细胞，繁殖扩大后再回输体内，使治疗基因在体内表示对应产物。,基因诊疗和基因治疗,第25页,基因导入细胞,生物学法,非生物学法,病毒载体所介导基因导入，是经过病毒感染细胞实现，其特点是基因转移效率高，但安全问题需要重视。,用物理或化学法，将治疗基因表示载体导入细胞内或直接导入人体内，操作简单、安全，不过转移效率低。,基因诊疗和基因治疗,第26页,（五）治疗基因表示检测,不论以何种方法导入基因，都需要检测这些基因是否能被正确表示。被导入基因,表示状态,能够用,PCR,、,RNA,印迹,、,蛋白印迹,及,ELISA,等方法去检测。对于导入基因,是否整合,到基因组以及,整合部位,，能够用,DNA,印迹技术,进行分析。,基因诊疗和基因治疗,第27页,三、基因治疗临床应用现实状况,1.,单基因遗传病基因治疗,只受一对等位基因影响而发生疾病属于,单基因遗传病,，设计基因治疗方案相对轻易，比如镰刀状红细胞性贫血、,-,地中海贫血、血友病等。基本方案是经过一定方法把正常基因导入到病人体内，表示出正常功效蛋白。,基因诊疗和基因治疗,第28页,2.,针对多基因病基因治疗,由多个基因相互作用结果，并受环境原因影响,而发生疾病属于,多基因病,，如高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、肿瘤等。,恶性肿瘤基因治疗包含：针对癌基因表示各种,基因缄默,、针对抑癌基因,基因增补,、针对肿瘤免疫反应细胞因子,基因导入,和针对肿瘤血管生成,基因失活,等等。,基因诊疗和基因治疗,第29页,亟待处理问题,缺乏高效、靶向性基因转移系统,缺乏切实有效治疗靶基因,对治疗基因表示还无法做到准确调控，也无法确保其安全性,缺乏准确疗效评价,基因诊疗和基因治疗,第30页,