中国药品检验标准操作规程

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,中国药品检验标准操作规程,年版,高效液相色谱法,中国药品检验标准操作规程,第1页,1,中国药品检验标准操作规程,第2页,1、对仪器普通要求,所用仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定时检定并符合相关要求。,中国药品检验标准操作规程,第3页,1.1 色谱柱,最惯用色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性添充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为惯用，辛基硅烷键合硅胶和其它类型硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，惯用填充剂有硅胶等。离子交换色谱使用离子交换填充剂；分子排阻色谱使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体分离通常使用手性填充剂。,中国药品检验标准操作规程,第4页,填充剂性能（如载体形状、粒径、孔径、表面积、键合基团表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱填充，直接影响供试品保留行为和分离效果。分析分子量小于化合物应选择孔径在15nm（1nm=10）以下填料，分析分子量大于化合物则应选择孔径在30nm以上填料。,除另有要求外，普通分析柱填充剂粒径普通在310m之间，粒径更小（约2m）填充剂惯用于填装微径柱（内径约2mm）。,中国药品检验标准操作规程,第5页,使用微径柱时，输液泵性能、进样体积、检测池体积和系统死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种项下要求色谱条件测定结果为准。,以硅胶为载体键合固定相使用温度通常不超出40，为改进分离效果可适当提升色谱柱使用温度，但不宜超出60。,中国药品检验标准操作规程,第6页,流动相PH值应控制在28之间。当pH大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH小于2时，与硅胶相连化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用PH大于8流动相时，应选取耐碱填充剂，如采取高纯硅胶为载体并含有高表面覆盖度键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶基键合填充剂等；当需使用PH小于2流动相时，应选取耐酸填充剂，如含有大致积侧链能产生空间位阻保护作用二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂、有机-无机杂化填充剂等。,中国药品检验标准操作规程,第7页,1.2 检测器,最惯用检测器为紫外检测器，包含二极管阵列检测器，其它常见检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。,中国药品检验标准操作规程,第8页,.紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不但与待测溶液浓度相关，还与化合物结构相关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器，对全部化合物都有响应；蒸发光散色检测器对结构类似化合物，其响应值几乎仅与待测物质量相关；二极管阵列检测器能够同时统计待测物吸收光谱，故可用于待测物光谱判定和色谱峰纯度检验。,中国药品检验标准操作规程,第9页,紫外、荧光、电化学和示差折光检测器响应值与待测溶液浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测溶液浓度通常呈指数关系，故进行计算时，普通需经对数转换。,中国药品检验标准操作规程,第10页,不一样检测器，对流动相要求不一样。如采取紫外检测器，所用流动对应符合紫外可见分光光度法（中国药典二部附录 A）项下对溶剂要求；采取低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂截止使用波长，并选取色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分流动相。,中国药品检验标准操作规程,第11页,1.3 流动相,反相色谱系统流动相首选甲醇,-,水系统（采取紫外末端波长检测时，首选乙腈,-,水系统），如经试用不适当时，再选取其它溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液流动相，必须使用时，应尽可能选取含较低浓度缓冲液流动相。因为,C18,链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相反相色谱系统，流动相中有机溶剂百分比通常应不低于,5%,，不然,C18,链随机卷曲将造成组分保留值改变，造成色谱系统不稳定。,中国药品检验标准操作规程,第12页,各品种项下要求条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组成百分比、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以适应供试品并到达系统适用性试验要求。其中，调整流动相组分百分比时，以组分百分比较低者（小于或等于50%）相对于本身改变量不超出30%且相对于总量改变量不超出10%为限，如30%相对改变量数值超出总量10%时，则改变量以总量10%为限。,中国药品检验标准操作规程,第13页,对于必须使用特定牌号填充剂方能满足分离要求品种，可在该品种项下注明。,中国药品检验标准操作规程,第14页,2、系统适用性试验,色谱系统适用性试验通常包含理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个参数。其中，分离度和重复性尤为主要。,按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用要求对照品溶液或系统适用性试验溶液在要求色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行调整，以符合要求。,中国药品检验标准操作规程,第15页,2.1 色谱柱理论板数(n)。,用于评价色谱柱分离效能。因为不一样物质在同一色谱柱上色谱行为不一样，采取理论板数作为衡量柱效能指标时，应指明测定物质，普通为待测组分或内标物质理论板数。,在要求条件下，注入供试品溶液或各品种项下要求内标物质溶液，统计色谱图，量出供试品主成份峰或内标物质峰保留时间,t,R,（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和峰宽（,W,）半峰高宽（,W,h/2,），按,n,16(t,R,/W),2,或,n=5.54(t,R,/W,h/2,),2,计算色谱柱理论板数。,中国药品检验标准操作规程,第16页,2.2 分离度（R）,用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间分离程度，是衡量色谱系统效能关键指标。能够经过测定待测物质与已知杂质分离度，也能够经过测定待测组分与某一添加指标性成份（内标物质或其它难分离物质）分离度，或将供试品或对照品用适当方法降解，经过测定待测组分与某一降解产物分离度，对色谱系统进行评价与控制。,不论是定性判别还是定量分析，均要求待测峰与其它峰、内标峰或特定杂质对照峰之间有很好分离度。除另有要求外，待测组分与相邻共存物之间分离度应大于,1.5,。,中国药品检验标准操作规程,第17页,2.3 重复性,用于评价连续进样后，色谱系统响应值重复性能。采取外标法时，通常取各品种项下对照品溶液，连续进样5次，除另有要求外，其峰面积测量值相对标准偏差应小于2.0；采取内标法时，通常配制相当于80、100和120对照品溶液，加入要求量内标溶液，配成3种不一样浓度溶液，分别最少进样2次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应小于2.0。,中国药品检验标准操作规程,第18页,2.4 拖尾因子（T）,用于评价色谱峰对称性。为确保分离效果和测量精度，应检验待测峰拖尾因子是否符合各品种项下要求。拖尾因子计算公式为：,T,W,0.05h,/2d,1,式中,W,0.05h,为,5%,峰高处峰宽；,d,1,为,5%,峰高出峰顶点至峰前沿之间距离。,除另有要求外，峰高法定量时,T,应在,0.95,1.05,之间。,峰面积法测定时，若拖尾严重，将影响峰面积准确测量。必要时，应在各品种项下对拖尾因子做出要求。,中国药品检验标准操作规程,第19页,3、测定法,3.1,内标法,按各品种项下要求，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各适量，混合配成校正因子测定用对照溶液。取一定量注入仪器，统计色谱图。测量对照品和内标物质峰面积或峰高，按下式计算校正因子,校正因子（,）（,A,S,/C,S,）,/(A,R,/C,R,),式中,A,S,为内标物质峰面积或峰高；,A,R,为对照品峰面积或峰高；,C,S,为内标物质浓度；,C,R,为对照品浓度。,中国药品检验标准操作规程,第20页,再取各品种项下含有内标物质供试品溶液，注入仪器，统计色谱图，测量供试品中待测成份和内标物质峰面积或峰高，按下式计算含量：,含量（C,X,）A,X,/(A,S,C,S,),式中,Ax为供试品峰面积或峰高；C,X,为供试品 浓度；A,S,为内标物质峰面积或峰高；C,S,为内标物质浓度；为较正因子。,采取内标法，可防止因样品前处理及进样体积误差对测定结果影响。,中国药品检验标准操作规程,第21页,3.2 外标法,按各品种项下要求，精密称,(,量,),取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，统计色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成份峰面积（或峰高），按下式计算含量：,含量（,C,X,）,C,R,(A,X,/A,R,),式中各符号意义同上。,因为微量注射器不易准确控制进样量，当采取外标法测定供试品中某成份或杂质含量时，以定量环或自动进样器进样为好。,中国药品检验标准操作规程,第22页,3.3 加校正因子主成份本身对照法,测定杂质含量时，可采取加校正因子主成份本身对照法。在建立方法时，按各品种项下要求，精密称（量）取杂质对照品和待测成份对照品各适量，配制测定杂质校正因子溶液，进样，统计色谱图，按上述3.1法计算杂质校正因子。此校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质实测峰面积。这些需作较正计算杂质，通常以主成份为参考，采取相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。,中国药品检验标准操作规程,第23页,测定杂质含量时，按各品种项下要求杂质程度，将供试品溶液稀释成与杂质程度相当溶液作为对照溶液，进样，调整仪器灵敏度（以噪音水平可接收为限）或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液主成份色谱峰高约达满量程1025或其峰面积能准确积分【通常含量低于0.5%杂质，峰面积相对标准偏差（RSD）应小于10%；含量在0.5%2%杂质，峰面积RSD应小于5%；含量大于2%杂质，峰面积RSD应小于2%】。然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液统计时间，除另有要求外，应为主成份色谱峰保留时间2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质峰面积，分别乘以对应校正因子后与对照溶液主成份峰面积比较，依法计算各杂质含量。,中国药品检验标准操作规程,第24页,3.4 不加校正因子主成份本身对照法,测定杂质含量时，若没有杂质对照品，也可采取不加校正因子主成份本身对照法。同上述3.3法配制对照溶液并调整检测灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，前者统计时间除另有要求外，应为主成份保留时间2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质峰面积并与对照溶液主成份峰面积比较，计算杂质含量。,中国药品检验标准操作规程,第25页,若供试品所含部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按要求先统计供试品溶液色谱图，再统计等体积纯溶剂色谱图。色谱图上杂质峰总面积（包含溶剂峰），减去色谱图上溶剂峰面积，即为总杂质峰校正面积。然后依法计算。,中国药品检验标准操作规程,第26页,3.5 面积归一法,按各品种项下要求，配制供试品溶液，取一定量注入仪器，统计色谱图。测量各峰面积和色谱图上除溶剂峰以外总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积百分率。,用于杂质检验时，因为峰面积归一化法测定误差大，所以，通常只用于粗略考查供试品