核酸理化性质 四川理工学院

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,4.4 核酸和核苷酸的性质,(Section 4 Properties of Nucleic acid and Nucleotide),一、溶解性Solubility,RNA、Nt、Ns和Base纯品为白色粉末或结晶体。,DNA为纤维状固体。,核酸为极性物质，核苷酸和核苷可溶于水。,核酸大多与蛋白质结合成和蛋白。在不同的盐浓度下，DNA蛋白DNP和RNA蛋白RNP溶解度不同。,1,核蛋白 +1mol/L NaCI DNP溶解+RNP,核蛋白 +0.14 1mol/L NaCI DNP +RNP溶解,(低盐DNP不溶，高盐RNP不溶),核蛋白 在pH4.2pH=pI时，DNP，RNP溶解,核蛋白 在pH22.5 pH=pI时，RNP ，DNP溶解,二、核酸及其组分的两性性质,1.碱基解离，第一位都在N上,解离位点：,A：在N1解离，G：在N7解离，,U：在N3解离，T：在N3解离，C：在N3解离，,2,2.核苷Ns解离,糖的存在使N解离pK值降低，而糖上OH的解离无足轻重pK 在12 以上,3.核苷酸Nt解离,Pi有两次解离，pK0.71.6 pK6.16.5,Nt含碱基和Pi，为两性电解质，当正、负解离速度相等时，该pH即为pI，U、T除外,不带电荷,pI=(pK+pK)/2，pK为Pi第一解离，pK为 N解离,eg.AMP pI=(0.9+3.8)/2=2.35,了解Nt的解离及pI，在制备及分析中极有帮助。,IP,2,IP,IP,2,IIP,3,2.核苷Ns解离,糖的存在使N解离pK值降低，而糖上OH的解离无足轻重pK 在12 以上,3.核苷酸Nt解离,Pi有两次解离，pK0.71.6 pK6.16.5,Nt含碱基和Pi，为两性电解质，当正、负解离速度相等时，该pH即为pI，U、T除外,不带电荷,pI=(pK+pK)/2，pK为Pi第一解离，pK为 N解离,eg.AMP pI=(0.9+3.8)/2=2.35,了解Nt的解离及pI，在制备及分析中极有帮助。,IP,2,IP,IP,2,IIP,4,4、核酸分子的解离Dissociation,核酸和多核苷酸链除了末端磷酸残基外，磷酸二酯键中磷酸残基只有一个解离常数，pK1=1.5,三、紫外吸收(260nm，定性和定量分析),但分子量差异大，纯质不一，难以用NA重量浓度来表示其消光系数，故常用摩尔磷消光系数.,(p)每升溶液中含1mol 磷的核酸溶液pH=7的消光系数。,260nm:DNA=7,00010,000 RNA=6,0008,000,5,四、核酸的变性与复性Denaturation and renaturation of NA,一 Denaturation of NA,定义:NA受热、酸碱、有机溶剂、辐射、及尿素等变性剂作用，皆引起变性，所谓变性：氢键断裂，双螺旋结构解开，从而引起紫外(p)增加hyperchromie effect，增色效应、失去生物活性、粘度下降双股无规线团与pr反、比旋下降 等性质改变的过程叫变性。(与降解不同，无共键的断裂),8,DNA,的变性,(denaturation),方法：,过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它理化性质变化：,OD,260,增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变；生物活性改变,DNA,变性的本质是双链间氢键的断裂,9,增色效应：,DNA,变性时其溶液,OD,260,增高的现象。,10,用途：,a.作为判断变性，复性的指标,变性hyperchromic effect增色效应，(p),复性hypochromic effect减色效应，(p),b.测NA浓度 常用,热变性及变性温度,热引起,变性温度(Tm)紫外吸收值达最高值的一半时溶液所处的温度(突发过程，相当窄的温度)。或双螺旋结构失去一半时的温度melting temperature，溶解温度，解链温度。DNA，Tm=7085oC。DNA变性Tm与以下因素有关：,11,样品均一性 越均一，温度越窄。是均一性的检验标准,溶液离子强度增高，,Tm,值增加,G,C,含量,pH 7.0,，,0.165M NaCl,中,DNA,的,T,m,值与,G,C,含量成正比。其它条件亦相似。可用下面公式计算,G-C,百分含量：,GCTm69.3,2.44,如某DNA Tm值在pH 7.0、0.165M NaCl中为80C,GC10.72.44=26.1,12,当,DNA,的稀盐溶液加热到,80-100,时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。,80 90 100,100%,50%,OD,260,（,254,）,Tm,变性温度范围,融解温度melting temperature,Tm：DNA热变性过程中，紫外吸收到达最大值的一半时溶液的温度称为融解温度Tm或解链温度、变性温度。,实验室常用的方法,热变性,13,1变性后理化性质改变,DNA溶液的粘度降低,浮力密度增加,旋光偏振光改变,紫外吸收增加高色效应,高色效应hyperochromic effect：DNA变性后，在260nm处的紫外吸收增高，称为高色效应或增色效应。,2变性后的DNA一级结构没有改变。,总结：,14,3融解温度melting temperature,Tm：DNA热变性过程中，紫外吸收到达最大值的一半时溶液的温度称为融解温度Tm,GC,含量越高，,Tm,越大,DNA,越长，,Tm,越大,溶液离子强度增高，,Tm,值增加,DNA,越纯，相变范围越小,15,二复性Renaturation,指变性DNA分子在适当的条件下，解开的互补双链可重新恢复天然的双链螺旋结构。,热变性的DNA在缓慢冷却后复性的过程称为退火。,复性条件：,1缓慢冷却,2片段小，易复性,3均质易复性,4浓度大易复性,5高度重复序列，易复性,减色效应hypochromic effect:DNA复性时，其溶液OD260降低。,16,复性速度常用Cot1/2表示,Co：变性DNA浓度(以Nt mol数表示)；,t：复性时间 秒。,Cot1/2表示DNA复性50 所需时间与DNA浓度的乘积。,17,在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件温度及离子强度下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。,这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,核酸分子杂交,(hybridization),18,核酸的杂交,19,20,DNA-DNA,杂交双链分子,变性,复性,不同来源的,DNA,分子,核酸分子杂交的应用:,研究基因的位置,确定两种核酸序列的相似性,检测样品中的特异序列,基因芯片技术的根底,21,核酸探针nucleic acid probe:能特异性的探测带某一特定序列的DNA或RNA分子的标记核酸分子。,22,核酸分子杂交,(hybridization),由不同来源的核酸单链形成杂化双链的过程,分子杂交技术的应用：基因克隆筛选、酶切图谱制作、特定基因序列的定量和定性、突变分析、疾病诊断等,23,4.5 Nt类物质的制备及应用,一、核酸组分Nt、Ns和Base的制备,一 降解方法,酸解NA，直接得碱基或无嘌呤酸，糖苷键断。PuPy purinepyrimidine；deoxyoxy,碱解RNA0.31M NaOH，得2,3 环式Nt，进一步生成 2或 3 Nt、Ns (Nt 代表核苷酸，Ns代表核苷的缩写,DNA无2-OH，不能生成2,3 环式Nt，相对抗碱。,24,酶解,限制性内切酶类，以后再讲。,外切酶类,1.牛脾磷酸二酯酶,作用方式:5-3外切,底物:RNA，DNA，5-OH专一，3断裂,产物:3 Nt,2.蛇毒磷酸二酯酶,作用方式:3-5外切,底物:RNA，DNA，3-OH专一，5断裂,产物:5 Nt。与桔青酶磷酸二酯酶同,25,二别离,水解产物经以下方法和技术别离：,纸层析,纸电泳,薄层层析,离子交换层析，大量生产,三应用,1.研究用试剂 肌苷用于血液保存，,2.强力味精鸟苷酸，肌苷酸与味精混合，鲜味增加几十倍,3.ATP，GTP改善代谢功能；5FU抗癌作用；聚肌胞=聚肌苷、聚胞苷，抗病毒，是干扰素诱导剂肝炎,26,二、Prperation of NADNA and RNA,一制备NA时注意的几个问题,防止核酸酶的水解,加核酸酶抑制剂或去核酸酶激活剂。,防止化学因素的降解,提取NA常用酸碱法，但要防止过酸过碱。,防止物理因素的降解,高温、机械等作用力破坏NA结构，应该在低温和温和条件下进行。,27,二DNA的制备,辛醇氯仿法,Et-OH,DNA水相 DNA,核蛋白溶液辛醇氯仿,Pro 水与氯仿相之间,SDS法,SDS将Pro变性，与DNA别离,苯酚法,苯酚将Pro变性，抑制Nuclease活性。活性DNA在水相,28,三RNA的制备,粗提方法：苯酚法；稀碱或盐溶液与pI联合使用。,提取不同RNA时，先用离心法别离细胞器，再提取相应的RNA。,如rRNA从核糖体中提取，tRNA从细胞质中提取，mRNA从多聚核糖体中提取。,精制方法：分子筛层析，密度梯度离心，DEAE-Sephadex，Poly dT 亲和柱(精制mRNA，与mRNA尾巴Poly A特异结合)等。,29,4.6 NA的分析测定和研究方法,一、NA及其组分含量的测定,一紫外吸收法朗白比尔定律,纯NA，DNA(1g/ml)=0.020A260nm,RNA(1g/ml)=0.0220.024A260nm,即一个A值50g/ml 双螺旋DNA,一个A值40g/ml RNA或单链DNA,二定糖法,RNAH+3，5二羟基甲苯苔黑酚，地衣酚,绿色产物A670nm,DNA+H+二苯胺 蓝色产物A600nm,三定磷法RNA和DNA总量,30,消化 定磷试剂NA(DNA和RNA)+H+有机磷转化为无机磷,蓝色产物总磷，A650nm660nm,核酸磷真实含量总磷无机磷,纯核酸含磷量约9.5%，1g磷10.5g核酸100/9.5,四琼脂糖凝胶电泳法尤其用于DNA测定和分析,DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳加溴乙锭，插入DNA中使荧光增强,荧光强度与DNA含量正比。与标准品对照可测定样品中DNA的量。,31,二、NA纯度分析,方法：测定双链和单链DNA的吸收光谱；双链向单链转化过程中的光吸收增加增色效应,三、DNA的PAGE,测定DNA、片断和基因的相对分子量大小。,常用标准分子量的DNA 作对照，计算样品DNA的分子大小。,鉴别分子量相同，但构象不同的DNA,在 PAGE中的迁移率大小：,超螺旋型SC)线形分子L 开环状分子OC,32,四、核酸分子杂交 Hybridization,热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构。,这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生杂交。,经典方法：现在少用,1RNA用同位素标记,2与变性DNA在0.9M NaCl，0.09M乙酸钠中66，保温24hr。,3RNase除去未结合RNA,4微孔膜过滤去除多余DNA,5测膜之放射性强度，计算杂交量,33,核酸的杂交,34,35,常用方法：,1.Southern blotting：,DNA+限制性内切酶 大小不同的DNA片断 琼脂糖凝胶电泳 NaOH变性处理 转DNA至硝酸纤维素膜 80 46h烘烤固定，与标记的序列的DNA探针在高盐浓度，68，10h杂交 冲